196229. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 40926 antibiotikum N-acilamino-glukuronil-aglikonjai és az A 40926 antibiotikum aglikonjai, valamint az ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196229 2 Az Actinomadura törzs sp. ATCC 39727 törzs tenyésztési jellemzői (folytatás) IV. Táblázat Fiziológiai jellemzők Vizsgálat Eredmények keményítő-hidrolízis negatív H2 S képződés a 6. sz. táptalajon negatív, ólomacetátos szalagokon pozitív 10 tirozin-reakció pozitív kazein-hidrolízis pozitív kalcium-malát hidrolí-15 zis negatív zselatin-folyósítás lakmusz-tej pozitív koagulálás negatív peptonizálás pozitív 20 cellulóz-bontás negatív nitrát-redukció pozitív V. Táblázat Szén forrás-hasznosítás 25 Szénforrás Növekedés arabinóz + xilóz + mannóz + 30 fruktóz + raf finóz + ramnóz + glukóz + laktóz + 35 galaktóz + inozit — szacharóz + cellulóz — szalicin + 40 mannit + ribóz — + = növekedés észlelhető ~ = nincs növekedés------------------------------------------------------------------4g Kemotaxonómiai jellemzés Sejtfal elemzés A sejtfalban jelenlevő aminosavak elemzését Becker és munkatársai módszereivel végeztük (Rapid differentiation between Nocardia and Strepto- 50 myces by paper chromatography of whole cell hydrolysates. Appl. Microbiol. 12, 421—423, 1964). A teljes sejt-hidrolizátum elemzése mezo-diaminopimelinsav jelenlétére mutat. A Kawamoto és munkatársai módszereivel (I. 55 Kawamoto, T. Oka, T. Mara: Cell-wall composition of Micromonospora olivoasterospora, Micromonospora sagamiensis and related organisms, J. Bact. 146, 527—534, 1981) előállított tiszta sejtfal elemzése glicin távolíétére mutat. 60 Cukorelemzés A cukortartalom meghatározását M. P. Lechevalier módszere szerint végeztük (Identification of aerobic Actinomycetes of clinical importance, J. g5 Lab. Clin. Med. 71, 934—944, 1968), vékonyrétegkromatográfiás lemezek alkalmazásával, a J. L. Staneck és G. D. Roberts által leírt módon (Simplified approach to identification of aerobic Actinomycetes by thin-layer chromatography, 28, 226— 231, 1974), a következő oldószer-rendszer alkalmazásával (térf./térf.): etilacetát:piridin:víz 100:35:25. A kapott eredmények arra mutatnak, hogy főleg glükóz és ribóz van jelen, és kisebb mennyiségben ugyancsak kimutatható a galaktóz, mannóz és a maduróz. Mikolsavak A mikolsavak jelenlétének kimutatására irányuló vizsgálatokat Minnikin és munkatársai (D. E. Minnikin, L. Alshamaony, M. Goodfellow: Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin layer chromatography analysis of whole organism methanolysates, J. Gen. Microbiol. 88, 200—204, 1975) módszere szerint hajtottuk végre. A vizsgálat eredménye negatív: mikolsavak nem találhatók. A törzs azonosítása A törzset az „Actinomycetes, Actinomadura genus” rendszertani helyre soroljuk be a következő ismérvek alapján: jelen van a mezo-diaminopimelinsav és a maduróz, nincs jelen a peptidoglikánban a glicin, hiányzik a mikolsav és mérsékelten hosszú spóraláncokat hordozó légmicélium képződik. Más mikroorganizmusokhoz hasonlóan az A 40926 antibiotikumot termelő törzs jellemzői is változásoknak vannak kitéve. Például előállíthatjuk a törzs mesterséges variánsait és mutánsait, különböző ismert mutagénekkel (pl. UV-besugárzással, röntgensugárzással, nagyfrekvenciájú hullámokkal, radioaktív sugárzással), vegyi anyagokkal (pl. salétromsavval, N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidinnel) és más módon való kezeléssel. Valamennyi természetes és mesterséges variánst és mutánst, amely az Actinomadura genus speciesei közé tartozik és A 40926 antibiotikumot termel, az Actinomadura sp. ATCC 39727 törzzsel egyenértékűnek tekintünk, A találmány szerinti antibiotikumoknak a termelő mikroorganizmus fermentlevéből való kinyerését ismert módon végezzük. Ezek a módszerek a következőket foglalják magukban: oldószeres extrakció, kicsapás nem-oldószerek hozzáadásával vagy az oldat pH-jának változtatásával, megosztásos kromatográfia, fordított fázisú megosztásos kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, affinitáskromatográfia stb. Kitüntetett eljárás a rögzített D-alanil-D-alaninon végzett affinitáskromatográfia, amelyet fordított fázisú oszlopkromatográfia követ. A találmány szerinti kinyerési eljárás szempontjából megfelelő rögzített D-alanil-D-alanin mátrixokat ismertet a 112555 sz. európai szabadalmi bejelentés. A találmány szerinti eljárás vonatkozásában a kitüntetett mátrix a meghatározott pórusméretű keresztkötéses polidextránnal összekapcsolt D-alanil-D-alanin. A fermentlé közvetlenül szűrés után vagy előzetes tisztítási eljárás után vethető alá affinitáskromatográfiának. Az utóbbi esetben a teljes fermentlevet meglúgosítjuk — a pH-t előnyösen 8,5 és 10,5 11
