196227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklikus, vazopresszin antagonista peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196 227 2 A puffer: 0,1% TFA B puffer: 0,25% TFA/CHjCN (4:6) 60% B; izokratikus; 235 nm (2,0 AUFS) injektálás: 10 mg/0,5 ml A puffer 17 mg tiszta cím szerinti termék 4. Ioncserélős kromatográfia Minta: 365 mg az l/a-ból és 2/a-ból; CMC; 0,01 M NHtOAc 0,1 M NFL,OAc-hez lineáris gradiens a) 51—70. frakció 93,5 mg b) 71—89. frakció 86,5 mg c) 91—110. frakció 65 mg d) 111—121. frakció 24,5 mg 2. példa J “ * A Pmp-D-Tyr-Phe- Val-Asn-Cys-Pro-Arg-OH előállítása Az 1. példában nyert Pmp(Bzl)-D-Tyr(Br-Z)-Phe-Val-Asn-Cys(OMe-Bzl)-Pro-Arg(Tos)-gyanta 4,2 g-ját (1,5 millimól) 4,5 ml desztillált anizolban oldjuk, majd 40 ml vízmentes hidrogén-fluoriddal reagáltatjuk 0°C-on egy órán keresztül. A fenti kezelés után a terméket vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot vízmentes éterrel kezeljük és leszűrjük, így 1,33 g nyers pepiidet kapunk. A Bzl csoport Pmp részről való eltávolítását nátrium/folyékony ammónia segítségével fejezzük be az 1. példában leírt módon. A kapott, védőcsoportot nem tartalmazó oktapeptídet 0,01 mól/1 kálium-(hexaciano-ferrát) oldatot használva cikíizáíjuk pH = 7—7,5-en, míg a szín 30 percen keresztül megmaradt, mint azt az amid előállításánál leírtuk. 600 mg dez-glicin-amid oktapeptídet kaptunk az oxidációs elegy ecetsavval való pH = 4,5-re való savanyítása és a reakcióelegy Bio-Rex-70 (H+ forma) oszlopon való kromatografálása után 1 1 5%-os ecetsavat használva eluensként. A Prhp-D-Tyr-Phe- Val-Asn-Cys-Pro-Arg-OH tisztítása 1. Ellenáramú elválasztás Minta: 600 mg a Bio-rex 70 oszlopról lejött termékből, n-BuOH/HOAc/HíO (4:1:5) 200. transzfer frakció a) 150—161. frakció 169mg b) 133—149. és 162—163. frakció 2. Preparatív HPLC Minta: 52 mg [az l/a-ból kapott termékből], Altex C18/25 cmx 10 mm, 10 mikron) A puffer: 0,1%-os TFA B puffer: 0,25%-os TFA/CH3CN (4:6) 60% B, izokratikus; 20,7 bar túlnyomás; 3,0 ml/min Injektálás: 10 mg/0,6 ml A pufferben 235 nm (2,0 AUFS) a) 24 mg b) 7,3 mg A 2/a-t és 2/b-t egyesítjük, HPLC-vel ismét megtisztítjuk, így 15 mg tiszta pepiidet kapunk. 3. Megosztásos kromatográfia Minta: 117 mg [1/A-ból] finomszemcsés Sephadex G-25 (2,5 x 55 cm-es oszlop) n-BuOH/ HOAc/HzO (4:1:5) eluens a) 32-36. frakció 83 mg tiszta termék 3. példa A Pmp-D-Tyr(Et)-Phe- Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2 előállítása A cím szerinti terméket benzhidril-amin-gyantát (BHA) használva állítjuk elő szilárd fázisú technika segítségével. így 1,0 g BHA-gyantát [1,13 millimól NHí/g gyanta] reagáltattunk 1,5 ekvivalensnyi Boc-Arg(Tos)-nal, 1,5 ekvivalens DCC-vel és 3,0 ekvivalens HBT-vel, melyeket dimetil-formamidban úgy készítünk el, hogy az oldat a Boc-Arg (Tos)-ra nézve 0,1 mól/I koncentrációjú legyen. A védőcsoport eltávolítást 50% TFA/metilén-klorid eleggyel, a semlegesítést 5%-os DIEA/metilén-klorid eleggyel végezzük. A peptidet lépésenként építjük fel az aminosavak egymás utáni kapcsolásával előzetesen elkészített Boc-aminoacil-szimmetrikus anhidridek 0,1 mól/1 dimetil-formamidos oldatát használva. A Boc-Asn-t, a Boc-D-Tyr(Et)-t és a Pmp(MBz)-t egymás után kapcsoljuk dimetil-formamidban oldott DCC-t és HBT-t használva. A kapcsolás teljessé válását a kvalitatív ninhidrin-próba segítségével követjük nyomon és amennyiben szükséges, újbóli kapcsolást végeztünk. A befejezett Pmp(MBz)-D-Tyr-(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(MBz)-Pro-Arg(Tos)-BHA-gyantához kötött peptidet metilén-kloriddal mossuk és állandó súly eléréséig szárítjuk (2,34 g). A peptidről a védőcsoportokat úgy távolítjuk el és a peptidet a gyantáról úgy hasítjuk le, hogy 30 ml vízmentes folyékony hidrogén-fluoridot és 4 ml anizolt adtunk hozzá 0 °C hőmérsékleten, és a reakciót egy órán keresztül folytatjuk. A kapott anyag vákuumban való szárazra párlása után a gyantát etil-éterrel mostuk, levegőn szárítjuk, majd háromszor 20 ml gázmentesített dimetil-formamiddal és négyszer 20 ml 20%-os ecetsavval mossuk. A dimetil-formamidos és savas extraktumokat 41 vízbe öntjük (az így keletkezett oldat pH- ja 4,5). A pH-t ammónium-hidroxiddal 7,2-re állítjuk és az oldatot 0,01 mól/1 káIium-(hexaciano-ferrát) oldattal titráljuk argon gáz atmoszférában addig, amíg a sárga szín fennmarad (85 ml). A pH-t 4,8-ra állítjuk jégecet hozzáadásával. Az elegyet leszűrjük és a szűrletet egy Bio-Rex 70 oszlopra (H+) öntjük. Az oszlopot 200 ml vízzel mossuk, majd a nyers peptidet 300 ml piridin/ecetsav/víz 30:4:66: térfogatarányú elegyével eluáljuk. Az eluenst vákuumban 30 °C hőmérsékleten bepároljuk. A maradékot 100 ml 0,2 n ecetsavban oldjuk, liofilizáljuk, így 507 mg cím szerinti nyers oktapeptidet kapunk. A Pmp D-Tyr(Et)-Phe Val-Asn-Cys-Pro-Arg-NH2 tisztítása 1. Ellenáramú eloszlás Minta: 607 mg nyers termék, n-BuOH/HOAc/HjO 4:1:5 240. frakció a) 154-170. és 190-2. frakciók 71 mg b) 171-189. frakciók 230 mg 2. Gélszűrés Minta: 123 mg a b) mintából Sephadex G—15 (2,5 x 55 cm-es) oszlop 0,2 N HOAc eluens 25 ml/ó áramlási sebességgel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
