196173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új alfa-hidroxi-tiotérek és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
41 196173 42 Amennyiben különböző hatóanyag-koncentrációkkal folytatjuk le a vizsgálatot, úgy a százalékos gátlás értékét minden egyes koncentráció vonatkozásában feljegyezzük és koordinátarendszerben ábrázoljuk oly módon, hogy a koncentráció logaritmusát az abszcisszára, mig a százalékos gátlás értékét az ordinátára visszük fel. Az ICso-értéket ezután lineáris regressziós analízissel állapítjuk meg. Emberi leukocitákból származó foszfolipáz M gátlásának meghatározására irányuló in vitro teszt .Buffy coats'-ból kiindulva többfokozatú frakcionált szedimentáció útján neutrofil polimorf magvú emberi leukocitákat izolálunk és ezeket mélyhűtéssel megfagyasztjuk. A foszfolipáz A2-t a sejtszuszpenzióból 2 n nátrium-klorid-oldatban levő és jéghideg 0,36 n kénsav hozzáadása közben végzett homogenizálással extraháljuk, majd centrifugálást végzünk (10 000 x g) és a felülúszót 4,5 pH-jú nátrium-acetátpufferrel szemben dializáljuk. Az enzimaktivitás meghatározása végett az enzimet (10-30 pg protein) 0,1 mólos trisz/HCl-pufferben (pH = 7) 1 millimól kalcium-klorid és a szubsztrátum hozzáadása mellett 37 °C-on 1 óra hosszat inkubáljuk. A szubsztrátum Eschericia coli-ból származó 2 jumól foszfolipid, amely bioszintetikusán "14C-olajsavval radioaktiven jelzett. A reakciót ezután Dole-reagens (izopronol-heptán-1 n kénsav térfogat szerint (v : v/40 : : 10 : 1 elegye) hozzáadásával beállítjuk, a foszfolipáz A2 által felszabadított 14C-olajsavat extraháljuk. Az egyidejűleg extrahált szubsztrétumot úgy választjuk el .teljesen, hogy a kivonatot szilikagél-oszlopon keresztül szűrjük. Az eluátumban levő 14C-olajsavat radiometriás módszerrel határozzuk meg. A vizsgálni kivánt anyagok foszfolipáz Aí-re kifejtett gátló hatásának meghatározása céljából ezeket vizes - dimetil-formamidos (végső koncentráció: max 5%, v/v) vagy vizes-etanolos (végső koncentráció: max. 2,5%, v/v) oldatban az inkubációs közegbe adjuk. A vizsgált anyagok hatásának erősségét ICso-értékkel fejezzük ki, ez azt a koncentrációt jelenti, ami a kontrollaktivitáshoz viszonyítva 50%-os gátlást eredményez. Az ICso-értéket grafikusan határozzuk meg oly módon, hogy a százalékos gátlást az ordinátára, míg a pmólban kifejezett koncentráció logaritmusát az abszcisszára visszük fel. A leirt kísérleti körülmények között a Mepacrin a foszfolipáz A2-re 1600 pmól koncentrációban fejt ki IC50-értékű gátló hatást. Emberi trombocitákból származó foszfolipáz C gátlásának meghatározására irányuló in vitro teszt .Buffy coats'-ból kiindulva frakcionált centrifugálással emberi trombocitákat nyerünk, majd ezeket mélyfagyasztásnak vetjük alá. A foszfolipáz C-t a sejtszuszpenzió ultrahanggal történő kezelésével felszabadítjuk és ezután 1 órán át ultracentrifugálást végzünk (1500,000 x g). Az enzim a felülúszó fázisban található, oldható formában. Az enzimaktivitás meghatározása céljából az enzimet (20-100 pg protein) 6 pH-jú 0,025 mólos trisz/maleát-pufferben 0,2 millimól kalcium-klorid és 0,02 millimól radioaktiven jelzett szubsztrátum hozzáadása közben 37 °C-on 5 percig inkubáljuk. A szubsztrátum: foszfatidil-[14C]-inozit. A reakciót kloroform - metanol 2 : 1 (v/v) eleggyel végzett kirázással leállítjuk. Emellett a fel nem használódott szubsztrátum a szerves fázisba megy át, mig a 14C-inozit-foszfát reakciótermék viszszamarad a vizes fázisban és azt egy alikvot rész radiometriás mérése útján meg lehet határozni. A vizsgálni kívánt anyagok foszfolipáz C-re kifejtett gátló hatásának meghatározása céljából ezeket vizes - dimetil-formamidos (végső koncentráció: max. 5%, v/v) vagy vizes-etanolos (végső koncentráció: max. 2,5%, v/v) oldatban az inkubációs közegbe adjuk. A vizsgált anyagok hatásának erősségét ICsc-értékkel fejezzük ki, ez azt a koncentrációt jelenti, ami a kontroliaktivitáshoz viszonyítva 50%-os gátlást eredményez. Az ICsc-értéket grafikusan határozzuk meg oly módon, hogy a százalékos gátlást az ordinátára, míg a pmól-ban kifejezett koncentráció logaritmusát az abszcisszára visszük fel. A megadott kísérleti körülmények között a Mepacrin a foszfolipáz C-re 20 pmól koncentrációban fejt ki IC50 értéknek megfelelő gátló hatást. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (I) általános képletű vegyúletek, továbbá a sóképzésre alkalmas tulajdonságokkal rendelkező (I) általános képletü vegyületek sói előállítására - a képletben a jelentése 1 és 3 közötti egész szám; R° hidrogénatom; R1 1-3 szénatomos alkilcsport, amely a végállású (terminális) szénatomon legfeljebb 17-es atomszámú halogénatommal helyettesítve lehet, vagy 1-3 szénatomos perfluor-alkil-csoportot jelent; R2 valamilyen 6-15 szénatomot tartalmazó alkilcsoport; A jelentése etiléncsoport, vagy ha R1 valamilyen halogénatomot tartalmazó 1-3 szénatomos alkilcsoport és/vagy B fe-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 22
