195979. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
23 195979 24 ca-patronban (Waters, PrepLC/System 500) kloroform, metanol, 96%-os ecetsav és víz 80: : 10:10:2 arányú elegyével kromatografáljuk. A mintát a futtató elegy 65 rnl-jében feladjuk a kiegyensúlyozott oszlopra és 25 ml/perc átfolyási sebesség mellett 23 ml-es frakciókra bontjuk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan, valamint analitikai HPLC segitségével minősítjük. A 29-34. frakcióban 195 mg V-citorodint találunk; tisztasága 80%, A-rendszerben mért Rn 0,38). A termék 60 g-ját preperativ vékonyrétegkromatográfiai (Merck DC-Kieselgél lemez) segítségével az A-rendszer szerinti oldószer-eleggyel tovább tisztítjuk. A Kieselgél sáv eluálását és a további feldolgozást 14. példában leirtak szerint végezzük. 16 mg tiszta V-citorodint kapunk. V-citorodin ^-NMR-színkép: 11. ábra abszorpciós színkép (nm) a) 235 (4.72) 254 (váll, 4.48) 290 (4.04) 495 (4.20) b) 235 (4.73) 254 (váll, 4.48) 290 (4.06) 494 (4.24) c) 244 (4.61) 268 (4.63)- 570 (4.22) 601 (4.19)-C60H8SN2O20, számított moltömeg: 1152 (FABMS által igazolt). 16. példa Az L-citorodin elkülönítése oszlop- és preparatív rétegkromatográfia segítségével Az I. tábla szerinti eljárással a tenyészléböl nyert nyers citorodin-elegy 6 g-ját 800 g 15-40 p szecseméretű Kieselgél (Merck) adszorbens kromatografáljuk. Eluáláshoz kloroform, metanol, 96%-os ecetsav és víz komponensekből álló gradienst alkalmazunk. Először 1,65 liter 80:10:10:2 arányú eleggyel (A-rendszer), majd ugyanezen rendszer 0,01% heptán-szulfonsav hozzáadásával készített módosított változatának 4 literjével, ezt követően 3,6 liter 70:20:10:2 arányú eleggyel és végül 2,8 liter 50:50:5:2 arányú eleggyel eluálunk. A mintát 50 ml A-rendszerben feloldva adjuk az oszlopra, és 1,65 liter előfrakció elengedése után 25 ml-es frakciókat szedünk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan, valamint analitikai HPLC segítségével minősítjük. A 161-225. frakcióban 1,1 g citorodin-elegyet találunk, amelynek L-citorodin-tartalma 24%. A kapott terméket a (teljes mennyiséget) 160 g 15-40 p szemcseméretű Kieselgél (Merck) adszorbensben kloroform, metanol, 96%-os ecetsav és viz 80:10:10:2 arányú elegyével kromatografáljuk. A mintát a fenti oldószer-elegyben feloldva adjuk a kiegyensúlyozott oszlopra, és 700 ml előfrakció elengedése utón 10 ml-es frakciókat szedünk. A 91-102. frakció egyesítésével 31 mg terméket kapunk 64% L-citorodin-tartalommal, a 103- -118. frakcióból 44 mg 68%-os L-citorodint különítünk el (meghatározás analitikai HPLC segítségével). Az egyesített termék 50 mg-ját preparat'v vékonyrétegkromatográfia segítségével (Merck DC lemez Kieselgél 60; futtató elegy: A-rendszer) tovább tisztítjuk. A Kieselgél sáv eluálását és a további feldolgozást a 14. példában leírtak szerint végezzük. 18 mg L-citorodint kapunk, amelynek analitikai HPLC módszerrel meghatározott tisztasága 74%. A kapott mennyiséget azonos feltételek mellett újból kromatografálva 14 mg tiszta L-citorodint kapunk. L-citorodin HI-NMR: 12. ábra a) 235 (4.59) 495 (4.1) 253 (váll) 295 (3.86) b) 235 (4.6) 495 (4.13) 255 (váll) 295 (3.91) c) 244 (4.61)-303 (3.87) 570 (4.1) 610 (4.15) 17. példa M-citorodin elkülönítése preparatív fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatografia (reversed phase HPLC) segítségével Sziliciumoxidon végzett preparatív HPLC segítségével nyert A-citorodin (erős tailing-et mutatott) 50 mg-ját kloroform, metanol és 10%-os vizes ammónium-acetát-oldat 150:1050: :?75 arányú elegyének 2 ml-jében feloldjuk, 1,6x25 cm méretű, 35 g Lichrosorb RP-18, 10 p (Merck) adszorbenssel töltött acéloszlopra adjuk, és nyomás alatt a fenti összetételű oldószer-eleggyel 2 ml/perc átfolyási sebesség mellett kromatografáljuk. Átfolyási fotométer segítségével 490 nm hullámhossz mellett figyeljük az eluálást, 4 ml-es frakciókat szedünk. Analitikai HPLC (4,4x250 mm) méretű, alkalmazásra kész oszlop, Linchrosorb RP-18, 10 p, (Merck) alapján az alábbi frakciókat egyesítjük: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
