195858. lajstromszámú szabadalom • Eljárás teicoplanin A2 komplex egyes fő komponenseinek szelektív feldúsítására
9 195858 10 kurzoraként működhetnek (pl. izovajsav, izovaleriánsav, 2-metil-vajsav, linolsav stb.), kivéve, ha ugyanakkor ezen komponensek közül egynek vagy többnek az arányát is növelni akarjuk. Általában előnyösek a kis 8zénatomszámú alkánsavakkal - mint pl. ecetsav, propionsav, vajsav - képzett észterek. A találmány szerinti eljárásban a fermentációs közeghez adagolandó „szelektive hatásos mennyiség" a prekurzor típusától függ. A kis szénatomszámú alkánsavak (izovajsav, 2-metil-vajsav, izovaleriánsav) és a telítetlen zsírsavak (linolsav, olajsav) észtereiből olyan mennyiséget alkalmazunk, hogy a fermentációs közegben koncentrációjuk 0,5 g/1 és 15 g/1, előnyösen 1 és 5 g/1 érték legyen. A kis szénatomszámú alkanolokból (izobutanol, 2-metil-butanol, izoamil-alkohol) és ezeknek a Tnikroorganizmusra nem mérgező savakkal képzett észtereiből olyan mennyiséget alkalmazunk, hogy a fermentációs közegben koncentrációjuk 0,5 és 5 g/1 előnyösen 1 és 2 g/1 közötti érték legyen. Az arainosavakból (vanilin, leucin, izoleucin) és a ketosavakból (alfa-oxo-izovuleriánsav, alfa-oxo-béta-metil-valcriánsav) valamint ezeknek sóiból és bázisaiból a fermentációs közeghez hozzáadandó „szelektive hatásos mennyiség" 0,5 g/ 1-től 5 g/l-ig, előnyösen 1 g/ 1-től 3 g/l-ig terjed. Ha a kis szénatomszámú alkánsavakat (izovajsav, 2-metil-vajsav, izovaleriánsav) a telítetlen zsírsavakat (linolsav, olajsav) vagy sóikat közvetlenül adjuk a fermentációs közeghez, a „szelektive hatásos mennyiség" 0,1 és 2,5 g/1, előnyösen 0,3 és 1,5 g/1 közötti érték. A T-A2 fókompononsei mennyiségének szelektív növelésére az ennél nagyobb koncentrációk is hatásosak, de a T-A2 komplex teljes kihozatala a mikroorganizmusra gyakorolt mérgező hatások miatt csökkenni fog. Az alábbi példákban részletesen ismertetjük a találmány néhány kivitelezési módját. 10 15 20 25 30 35 40 45 1. példa Általános eljárás 50 Ferde zabliszt-agaron tenyésztett Actinoplanes tsichomyceticos nov. sp. ATCC 31121 törzset beoltunk egy 500 ml-es palack- 55 ba, amely 100 ml-t tartalmaz az alábbi összetételű táptalajból: Glükóz 10 g/1 Peptone Difco 4 g/1 élesztőkivonat 4 g/1 00 Magnézium-szulfát 0,5 g/1 Kalcium-karbonát 5 g/1 RiLka elemeket tartalmazó oldatok: 1- -1 ml az A, B és C oldatból Víz 1000 ml 55 (sterilizálás után a pH-t 6,7-re állítjuk be) A oldat: 10 tömeg% nátrium-klorid B oldat: 10 tömeg% kalcium-klorid C oldat: 50 mg bórsav, 4 mg réz-szulfát, 10 mg kálium-jodid, 20 mg vas(III)-klorid, 40 mg magnézium-szulfát, 40 mg vas(ll )-szulfát és 20 mg ainmónium-molibdenát, 100 ml desztillált vízben oldva. Forgó rázógépben 36 órán át végzett erjesztés után a tenyészetnek 5 ml-es adagéival beoltjuk a vizsgálandó és a kontroll palackokat, melyeknek mindegyike 100 ml-L tf rtalmaz az alábbi összetételű táptalajból: L'feszet.ő-hidrolizátum 5 g/1 Aszparagin 1,5 g/1 Glükóz 20 g/1 Magnézium-szulfát 0,5 g/1 Kalcium-karbonát 5 g/1 Ritka elemeket tartalmazó oldat 1-1 ml az A, B és C oldatból (sterizlizálás után a pH-t 6,9-re állítjuk be). Az A, B és 0 oldat összetétele a fent magadott. Az erjesztést 28-30 °C-os hőmérsékleti n, forgó rázógépben végezzük. 24 óra elteltével hozzáadjuk a megfelelő prekurzort. A U nyészctet 72 óra múlva lecentrifugáljuk, és a fermentum 50 mikroliteres mintáiból meghatározzuk a T-A2 fő komponenseinek koncentrációját. Az elemzést az alábbi nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás módszerre] végezzük: a) Elválasztás fordított fázisú megoszlási kromatográ fiával Berendezés: Oszlop: Mobil fázis: Gradiens-profil: lejek tálas: Varian 5000 A tip. szivattyú; 254 mikrométeréé Varian detektor; Rheodyne 7125 tip. injektor; Spectra Physics 4000 tip. integrátor; Zorbax B0DS 5 mikrométer, 4,6 x 150 nm; (Du Pont) A) 0,025 M metil-cianid, 1 : 9 Nátrium-dihidro-foszfát, pH r 6,0 B) 0,025 M metil-cianid, 7 : 3 nátrium-dihidro-foszfát, pH = 6,0 0 és 50% B között 30 percen át lineáris. Áramlási sebesség 2 ml/perc. 50 mikroliter a fermentációs léből Retenciós idők (perc): 6
