195857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amidált peptidek vagy polipeptidek előállítására
14 195857 15 mennyiségű cc-amidáló enzimet alkalmaz.tunk. A lísJ-D-Tyr-Val-Gly-nek l“J-D-Tyr-Val-.-amiddé, valamint a dansyl-Tyr-Val-Gly-nak dansyl-Tyr-Val-amiddá történő konverziójának elemzése azt mutatja, hogy bármely időpontban megközelítőleg 1,55-ször több jódozott szubsztrátum alakul át, mind dansvl-szubsztrátum. (gy, ha a technika állása szerint ismert mérési rendszeri összehasonlitjuk _a saját mérési rendszerünkkel, akkor megközelítőleg 1,5-szörös konverziós faktort kell alkalmazni, az általunk alkalmazott dansyl-szubsztrátumos módszerre vonatkozóan. A továbbiakban egy némileg szigorúbb kinetikai elemzést alkalmaztunk a saját dansyl-Tyr-Val-Gly mérómódszerünknek a technika állása szerint ismert D-Tyr-Val-Gly mérőmódszerével való összehasonlításra. Ez az elemzés a kővetkezőt mulatja: Szubsztrátum K’(/um) Vnax(pmól termék min*17 pl) D-Tyr-Val-Gly 37 31 (ismert módszer) Dansyl-Tyr-Val-Gly 1,7 21 (saját módszer) A maximális sebesség (VBa.\) mindkét szubsztrátumra vonatkozó összehasonlításából látható, hogy a technika állása szerint ismert D-Tyr-Val-Gly megközelítőleg 1,48-szor nagyobb aktivitást eredményez, mint az általunk alkalmazott dansyl-Tyr-Val-Gly. Ez megegyezik a fentebb leírt részletekkel és azokat alátámasztja. 10. példa Az aktivitás összehasonlítása Eipper (PNAS) az 5147. oldalon (4. ábra) közli, hogy a V„ax óránként 39 pikomól/ /mikrogramm. Ez megfelel 0,65 mU/mg fehérje/perc specifikus aktivitásnak. Ez a legmagasabb aktivitás, amelyet a technika jelenlegi állása szerint közöltek. Ha ezt a fentebb említett 1,5 konzerviós faktorral osztjuk, akkor 0,4 mU/mg fehérje/perc. specifikus aktivitást kapunk. Ezt az értéket közvetlenül összehasonlíthatjuk az általunk elért, fentiekben leírt specifikus aktivitásokkal. Amint fentebb közöltük, mi legalább 25 mU/mg fehérje aktivitást értünk el, ami 60- -1000-szer nagyobb aktivitást, jelent, mint az Eipper (PNAS) által közölt aktivitás. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1. Eljárás oc-amidált peptidek vagy polipeplidek előállítására karboxil-terminális glicinc.iuiportot tartalmazó peptidekból vagy polipeptidekből, azzal jellemzve, hogy az említett peptideket vagy polipeptideket min. 25 ml /mg fehérje aktivitású (dansyl-D-Tyi— Val- Glv-COOH dansyl-D-Tyr-Val-CONH2-vé alakításakor 37 "C-on pH 45 7-nél meghatározva) peptidi]-glicin-cc-amidáló monooxigenázt tartalmazó tisztított onzimkészítmények jelenlétében - amely lényegében más proteolitikus, a kiindulási peptideket vagy polipeptideket, az amidéit peptideket vagy polipeptideket, valamint magát a peplidil-glicin-oc-amidáló monooxigenázt lebontani képes enzimet nem tartalmaz, és amely enzimet úgy nyertünk, hogy pajzsmirigy velő karcinoma szövetei, pajzsmirigy velő karcinoma sejtvonalat vagy ilyen sejtvonalakat tartalmazó szövettenyészetek tápközegét anioncserélő kromalográfisínak, majd méretkizárásos kromatográfiának, majd az ezeknél kapott peptidil-glicin-cc-amidáló monooxigenázt tartalmazó eluens frakciót erős anioncserélő kromatográf iának vetettük alá - oxidálunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy min. 50mU/mg fehérje aktivitású enzimkészítményt alkalmazunk. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy homogén, tisztított enzimkészítményt alkalmazunk. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy patkány pajzsmirigy velő karcinómából kinyert enzimkészítményt alkalmazunk. 5. A 4. igénypont szerinti ejárás, azzal jellemezve, hogy IVI-10028 szám alatt deponált és IVI-10029 szám alatt deponált pajzsmirigy velő karcinoma sejtvonalból származó enz:mkészilmónyl alkalmazunk. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemzve, hogy 60 000- -65 000 dalion molekulatömegű peptidil-glicin-cc-amidáló enzimet alkalmazunk. 7. A 2. vagy 3. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy SDS/poliakrilamid gélelektroforézisnél egyedi, homogén, jól definiált csikót mutató, tisztított enzimkészitményt alkalmazunk. 10 ábra A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 89.917.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkö István vezérigazgató 9
