195839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978 C jelzésű ciklusos peptid származékok előállítására
II 195839 12 nyűk. Például o törzsek mesterségen variánsai óh mutánsai állíthatók elő ismert mulagénőkkel, mint UV-, röntgen-sugárzással, nagyfrekvonciájú hullámokkal, radiokatív sugárzással (is kémiai anyugokkal való kezelés útján. Az Actínop/ancs-bő! olóállítható és az enzimet termelő valamennyi természetes és mesterséges mutáns felhasználható a találmány szerint. H. Oozac/fezésí körülmények A kiindulási anyagónt használt szubszlrátol. előnyösen hozzáadjuk a mikroorganizmus tenyészethez, a tenyészet mintegy 48 órás inkubálásu után. A roakcióközogben a szubsztrát koncentrációja széles határok kőzöll. változhat. Mégis az enzim maximális felhasználása céljából és 3 órai időtartamon belüli teljes doz.acilozéshoz a szubsztrát koncenlrációtarlománya körülbelül 1-3 mg/ml. Alacsonyabb koncentrációk is használhatók, de ilyenkor nem használjuk fel teljesen az enzimet; magasabb koncentrációk ugyancsak alkalmazhatók, de ilyenkor esetleg a szubszlrát nem dezacileződik tökéletesen, hacsak nem növeljük a fermentáció idejét. A szubsztrát antibiotikumot A-21978C maggá a találmány szerint legelőnyösebben akkor alakíthatjuk át, ha a fermentációs közeg pll-jút mintegy 7,0-7,2 tartományban tartjuk. pH 7 alatt a dozacilozés lassan folyik le; amint a pH moghaladja n 7,2 értéket, a képződött mag egyre inkább lúgos hidrolízisnek vari kitéve. Kevert fermentorokban a pH érzékelő vezérlővel szabályozható. Ahol ez nem praktikus, például lombikos fermentációnál, a pH szabályozása céljából a tápközoghez a szubsztrát hozzáadása előtt 0,1 mólos foszfátpuffert adunk. A szubsztrát. hozzáadása után a tenyészet inkuhálását mintegy 3-6 órán át vagy még tovább folytatjuk. A szubsztrát tisztasága befolyásolja n dozacilozés sebességét. Például 50% vagy nagyobb tisztaságú szubsztrát 3 óra alatt dezacileződik mintegy 2,5 mg/ml sebességgel. Kevésbbé tiszta szubszlrá tokai használva a dozacilozés valamivel lassabb ütemben megy végije. Többszöri szí ibsztrál-bn táplálási végezhetünk. Például 0,75 mg/ml antibiotikumot 24 órás időközökben táplálhatunk be legalább 5 vagy több alkalommal. A dozacilozés széles bömérsékiottartomáuybari hajtható végro, például mintogy 20- -45 °C között. Mégis optimális dozacilozés elérése és a szubsztrát. és a mag stabilitása érdekében a dnzacilozósl előnyösön mintogy 30 "C-on hajtjuk végre. C. A .szubsztrát Előnyös, do nem alapvotő tisztított antibiotikumot használni szubsztrátként. A tisztított szubsztrát vízben vagy pufferben oldódik, ezért kényelmesebben kezelhető. Ezenfelül tisztított szubsztráttal a dezacilezés lefolyása gyorsabb. Csak 15% kiindulási antibiotikumot tartalmazó féltiszta szubszlrátok már kielégi lőe i > dezaoilczöd ne k. A szubsztrát antibiotikumok antibaktoriális hatékonysággal rendelkeznek. Bár a szubsztrát anyagok (főleg a kis tisztaságnak) baktóriumnejtaket vagy spóráknl rejtegethetnek, amelyek foltohotőori növekedni tudnának a dozacilcző közegben és befolyásolhatnák a dezacilozcsi reakciót vagy a kiindulási antibiotikum vagy a termék mag stabilitását, ilyen jelenségeket nem figyeltünk meg. Ezért nem szükséges, hogy szubszlrátok sterilok legyenek, különösen rövid dozaciloző periódusok esetén. D. A dezacilezés ellenőrzése Az A-21978C komplex Co, Cj, Ci, Ca, C« és Cr. fai torai anlibakleriális anyagok, amelyek különösen Micrococcus luleus ellen hatásosak. Ezért a jelenlevő szubszLrát mcriynyisógének u meghatározására M.JitleusL alkalmazó próbát részesítünk előnyben. A képződő A-2J978C mag vízoldhntó, de biológiailag inaktiv. Ezért a biológiai aktivitás csökkenése a dezacilezés jó becslést adó, gyors próbája. A képződött mag mennyiségileg HPLC-elomzéssel mutatható ki, a már leírt rendszert alkalmazva. E. Nyug'ró sejtek használata A dezacilezés egyik alternatív eljárása során a sejteket eltávolítjuk a Lápközegből, pufforold itban újraszuszperidájjuk és a dozacilozést a B. fejezőiben leírtak szerint elvégezzük, E rendszer alkalmazása esetén az enzimatikusun aktív micéliumok újrahasználhatok. Például az A. ulahensís NRUL 12052 micéiiumck dczaciláz aktivitása hűtés mellett (4-8 °C) vogy lcfugyaszloLl állapotban (-20 "C) 1 hónapos vagy hosszabb tárolás után is megmarud. Előnyben részesítjük a 0,1 mólos foszfátpuffert. E. immobilizáll onzimok A dezacilezés végrehajtásának egy további módszere az enzim ismert eljárásokkal való immobilizálása (lásd például „Biomedical Applieati >ris of Immobilized Enzymes and Proteins", Thomas Ming Swi Chang, Ed., Plenum Press, Now York, 1977, 1. kötet). Az immobilizál . enzim azután oszlopban (vagy más alkalmas típusú Peak Lor ban) használható a dezacilezés végrehajtására. Ezenfelül a mikroorganizmus maga i ni mobilizálható és a dozacilozcsi reakció katalizálására használható. 5, 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 G0 65 7
