195839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978 C jelzésű ciklusos peptid származékok előállítására
25 195839 2G Ugyanő/,!, a próbál használjuk annak n megállapítására, hogy inás mikroorganizmusok lormelni Ludják-e a kívánt A-21978C magol. Jla a fenti eljárásban AcLinoplanes utahensis NRRL 12052 hclyoll különösön Actinoplanos missouriensis NRRL 12053-al, Aclinopianos sp. NRRL 8122-1, AcLinoplanes sp NRRL 12065-ül ós Slroplosporangium i'osnura var. hollandensis NRRL 120G4-el használunk, a kívánt mag lormeléso bokövolkozik. Az A. utahensis dozacilozö onzim alkalmazásával kapott mag aulenlikus mintáival való összehasonlító IIPLC elemzések igazolják, hogy a fentebb felsorolt egyéb mikroorganizmusok is termelik az A-21978C magot. C, Az A-21978C mag izolálása A 13. fejezetben leírtak szerint kapott teljes fcrmontlovol {20 liter) szűrési segédanyaggal (Hyflo Super-Col, Johns Manvillo Corp.) átszűrjük. A micólium eltávolítása után a szűrlotlevet 1,5 liter HR-20 gyantái (DIAION High Porous Polymer, ÍIP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. A kapott effluensl elöntjük. Az oszlopot ioninentesitett vízzel (10 liter) mossuk a szűrtlé maradókénak eltávolítása céljából. A mosófolyadékot (döntjük. Ezután az oszlopot 10 liter térfogatú víz/acetonitril elegyekkel (95:5, 9:1 és 4:1) eluáljuk, 1 literes frakciókat gyűjtve. Az elúciót analitikai HPLC-vel ellenőrizzük, fordított fázisú szilikagél/Cm adszorbenst és 0,1% ammónium-acetátot tartalmazó víz/mctnnol (3:1) oldószerrendszort használva, a magot UV monitorral 254 nm hullámhossznál detektálva. A magot tartalmazó frakciókat egyesítve, az acetonitrilt vákuumban lopárolva és a maradékot gyo.rshűtéssel szárítva 40,G g félig tisztított A-21978G magot kapunk. D. Az A-21978C mag tisztítása A C. fejezetben leírtak szorint kapott félig tisztított magot (15 g) 0,2% ecolsavat ós 0,8% piridint tartalmazó 75 ml víz/melanol/acetonilril (82:10:8) ologyben odjuk. Az oldatot 3,33 liter* szilikagól (Quantum LP-1) /Cm töltetet tartalmazó, 4,7 x 192 cm-os oszloprn szivattyúzzuk. Az oszlopot a fenti oldószórrondBzerrel eluáljuk. 350 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az elválasztást 280 nm hullámhosszon UV-monitorral detektáljuk. A magot tartalmazó frakciókat egyesítve, az oldószereket vákuumban lopárolva és gyorshű- Léssol szárítva 5,2 g tisztított A-21978C magot kapunk. 2. példa Alternativ eljárás az A-21978C mag clóállilására Az A-21978C magot az 1. példában leírt eljárás szerint állítjuk elő, kivéve bizonyos változtatásokat a 11. fejezetben. Az A. ultihensis tenyészetet először mintegy 48 óráig inkubáljuk; a szubsztrát félig tisztított A-21978C komplex (50 g); a szubsztrát hozzáadása után az inkubálási idő körülbelül 1G óra. A szűrllcvet 3,1 liter HP-20 gyantát tartalmazó oszlopon bocsátjuk ét. az oszlopot 10 térfogat vízzel mossuk, majd víz/acclonitril (95:5) eleggyel eluáljuk. Az elúciót az 1. példában leírtak szerint detektáljuk. 24 liter összegyűjtése után az eluenst kicseréljük víz/acetonitril (9:1) elogyro. A magol tartalmazó frakciókat ezzel az oldószerrel eluáljuk. E frakciókat egyesítjük, az ncetonitril eltávolítása céljából vákuumban Leporoljuk és gyorshűtéssel szárítjuk. 24,3 g félig tisztított A-21978C magot kapunk. E félig tisztított magot (24,3 g) vízben (400 ml) oldjuk. Az oldatot 0,2% cceLsavat és 0,8% piridint tartalmazó viz/metanol/acctonitril (8:1:1) eleggyel készült 3,33 liter szilikagél (Quantum LP-1) /Cm töltetet tartalmazó, 4,7 x 192 cm-os acéloszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopot a fenLi oldószerrel körülbelül 13750 kPa nyomáson eluáljuk, 350 ml-cs frakciókat gyűjtve. Az elúciót 280 nm-nél UV-monitorral detektáljuk. A magot tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószereket vákuumban lepároljuk és a maradékot gyorshűtéssel szárítjuk. 14 g nagy tisztaságú A-21978C magot kapunk. 3. példa Noni~l~BOC-A-21978C Ci (nátriumsú) C-t és Cd faktorok előállítású A-219780 Ci és C3 faktorok keverékét (10 g) (előállítva a 4,208,403 számú nmorikui egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint) vízben (50 ml) oldunk szonikálás közben (200 mg/uil). Az oldat pll-jál 4,05-ről 9,5-ro állítjuk be 5n nátrium-hidroxid-oldnt (3,6 ml) segítségével. Di-torc-bulil-dikurbonátot (3,0 ml) adunk hozza és a ronkcióclogyot szobahőmérsékleten 2 óráig keverjük. Az elegy pll-jál 9,5-ön tartjuk 5n nátrium-hidroxid-oldat kézi hozzáadásával (G,5 ml lúghozzúndás 2 óra ulatt). A reakciót időnként szilikagól TLC-vel ellenőrizzük, acetonitril/vlz (7:3 ós 8:2) oldószer-rendszert használva és UV fényben detektálva. Körülbelül 10 perc múlva az oldat gyorsan mogzavnrosodik és a lúgfogyasztás emelkedik. 30 perc múlvo csökken a zuvarosság sebessége és n lúgfogyasztás ütomo, a rouk-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 G0 05
