195734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpes simplex vírus elleni védőanyagok előállítására
13 195734 14 antitesttel ( közömbösítés és a típusra vonatkozóan közös radioimnuinkicsapás). Magát a l'ülipeptidet, valamint ennek egy alkalmas vivőfehérjére .kapcsolt" fajtáját (mint a .kulcslyukba’ illeszkedő hemoeianin, KLH) - e kapcsolás a karboxil-lerminális císztein-maradékkal végbemenő Kovalens kötés útján történt - Felhasználtuk, hogy a gD-1 és gD-2-vel kapcsolatban fentebb leírt módon kísérleti állatokat halálos fertőzéssel szemben immun izáljunk. Találmányunk további jellemző vonásai cs előnyei a jártas szakember számára nyilvánvalóvá válnak az alább következő részletes leírásból és a találmány megvalósítási (kiviteli) formáit bemutató példákból. A találmány szerinti HSV-l-böl származó gD-1 glikoproteidet úgy kapjuk, és a HSV-2- ből származó gD-2 glikoproteidet előnyösen úgy kapjuk, hogy a HSV burkából származó glikoproteid-keveréket egy monoklón, gD elleni antitestből élló immunadszrobensen gyorsan és magas hozammal tisztítjuk. Amint fentebb mér említettük, a HSV burkában lévő glikoproteidek megfelelő forrásai például a vírusrészecskék burka, fertőzött sejtek plazmamembránjai és HSV-vel fertőzött sejtek detergetissel kezelt citoplazmakivonatai. A legutóbb említett forrás előnyös. A találmány szerinti gD-1 és gD-2 tisztítására szolgáló immunadszorbensek elkészítésére gD elleni antitestforrásként bármely monoklón, antitestet termelő hydridoma sejttörzs alkalmazható. Az alkalmazható, antitestet termelő törzsek között van az Eisenberg és munkatársai által leirt 17 hydridoma [J. Virol. dl, 478 (1982)]. A jelenleg előnyös, tisztításra alkalmazott monoklón HD-1 antitest, mely mind a gD-1, mind a gD-2 esetében immunadszorbenskérit alkalmazható az affinitásos kromatográfiéhoz, a következő sajátságokkkal rendelkezik: 1 ) igen erélyesen és megközelítőleg azonosan kőzőmbösiti mind a HSV-l, mind a HSV-2 fertózöképességét [Dix és munkatársai: Infection and Immunity, 3-1, 192 {1981 )J; 2) radioimmunkicsapási (RIP) vizsgálatok azt mutatták, hogy a gD-nek több mint 90%-a HD-l-hez kötve marad 37 °C hőmérsékletű 2 órás inkubálás után; 3) a HD-1 a gD-t az összes vizsgált HSV-l és HSV-2 törzsekben felismeri. E sajátságok elemzéséből azt a következtetést vontuk le, bogy u HD-1 felismer egy olyan, a típusra vonatkozóan általános, antigén determinánst, mely mind a gD-l-en, mind a gD-2-n jelen van, és ezt. az antigén determinánst viszonylag nagy affinitással megköti, A HD-1 antitestek előnyös forrása egy olyan ascites-folyadékból származó lgC frakció, amelyet HD-1 hybi-idoma sejteknek alkalmas, immunológiai választ adó állatokba való intraperitoneális adagolása eredményez. Előnyös matrix a Sepharose 4B (Pharmacia), azonban más antitest-immobilizáló rendszerek is alkalmazhatók [lásd például: Biotechnology Newswatch, 2. köt. 2. szám, 3. old. (1982. január 18.)]. Az alábbi 1. példában tehát bemutatjuk a citoplazmakivonatok előállítását, továbbá a gD elleni HD-1 antitest és a HD-1 immunadszorbens előállítását és sajátságait. Ahol különleges körülményekkel vagy eljárásokkal kapcsolatban az .előzetesen' vagy .előzőleg' megjelölést használjuk, ez annyit jelent, hogy ezeket a feltalálók és munkatársaik fentebb idézett közleményeikben kifejtették. 1. példa 1. A sejtek jelölése és a citoplazmakivonatok előállítása. A fertőzött sejtek pulzusjelölésének feltételeit előzőleg közölték. A gD tisztítása céljából egyes módosításokat vezettünk be, hogy a beépülő jelzés mennyiségét és a színtelizálódó gD mennyiségét megnöveljük. Minden egyes kísérletünkben tíz forgó lombikot (490 cm2), amelyek KB vagy BHK sejteket tartalmaztak, 20 lemez képzőegységet tartalmazó HSV-l törzzsel (HF törzs) vágj’ 10 p. f. u. HSV-2 törzzsel (SAVAGE törzs) fertőztünk. A fertőzés után 2 órával a sejteket felülrétegeztük 50 ml Eagle-féle minimáltáptalajjal (Minimal Essential Medium, a továbbiak-ban: MEM), mely 5% natális borjúszérumot tartalmazott (Dutchland Co.) A fertőzés után 5 órával a forgó lombikok egyikéből a közeget dekantáltuk, és a sejteket 37 °C-ra melegített Hank-féle sókkal (anionos felületaktív anyag) mostuk, majd felülrétegeztük 5,0 ml olyan Hanksókészítménnyel, mely a megfelelő radioizotópot tartalmazta, ezek: 35S-metionin (fajlagos aktivitása nagyobb, mint 600 Ci (mmol) linCi; 2,3-3H-arginin (fajlagos aktivitás 15 Ci(mmol) lmCi. Ezt követően 30 perccel a sejteket felülrétegeztük 25 ml előmelegített, - teljes MEM-mel, és az összes lombikokat további 7 órán át inkubáltuk. A fertőzés után 12 órával mind a jelzett., mind a jelöletlen sejteket négyszer mostuk jégbe hütött konyhasóoldattal, amely 0,1 mmól fenil-raetil-szulfonil-fluoridot (a továbbiakban: PMSF) tartalmazott, és elkészítettük a citoplazmakivonatokat. Minden egyes, sejteket tartalmazó lombikba 5 ml hideg lizáló (lizist okozó) pufferoldatot (0,01 mólos Trisz-puffer, pH értéke 7,5, mely 0,15 mól nátríum-kloridot, 0,5% Nonidet P-40 (polioxi-etilénoktilfenol) a továbbiakban: NP-40 (Shell Oil Gyártmány és 0,5% dezoxikolsav-nátriunisót tartalmaz) adagoltunk, és a sejteket megközelítőleg 5 percen át 4 nC hőmérsékleten inkubáltuk. Ekkor tolil-szulfonü-(fenil~alanil)-(klór-metil)-ketont (a továbbiakban: TPCK) és N-u-tozil-L-lizin(klór-metiD-keLorit (a továbbiakban: TLCK) tettünk hozzá - mindegyiket 0,1 mmól konr 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
