195580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pajzsmirigy antigének elleni antitestek kimutatására
t 195 580 A találmány tárgya eljárás pajzsmirigy antigének elleni antitestek kimutatására. A pajzsmirigy betegségek diagnózisában a pajzsmirigy antigének elleni antitestek kimutatása diagnosztikus értékű, es a betegségek aktivitását, lefolyását mutatja. Erre a célra legáltalánosabban elfogadott és széles körben használt módszerek a radioimmuno-assay-k. Ennek hátránya, hogy nem minden kórház rendelkezik izotóp laboratóriummal, ahol a vizsgálat elvégezhető, valamint az alkalmazott R1A kitek költségesek. Ismertek olcsóbb módszerek is, melyek általános, jól felszerelt laboratóriumokban elvégezhetők. Ilyenek a thyreoglobulin és mikroszóma antigén elleni antitestek kimutatása passzív haemagglutinációval. Ezeknek a módszereknek az érzékenysége alacsony, nehezen standardizálhatok. Célul tűztem ki olyan eljárás kidolgozását, mely a fenti hátrányokat kiküszöböli és rutinszerűen alkalmazható kórházi-klinikai laboratóriumokban a betegellátás területén. Kísérleteim során arra a felismerésre jutottam, hogy a különféle pajzsmirigy antigéneket, így TSH receptor, human thyreoglobulin, pajzsmirigy mikroszóma tisztított antigének egyikét nitroccllulózc filterre felcseppentjük, szárítással rögzítjük és a felcseppentett antigén mennyiségét tisztaságától függően optimalizáljuk 0,1—100 mikrogramm értékben, majd a nitrocellulóze filter többi kötőhelyét indifferens fehérjével, általában bovin szérum albuminnal blokkoljuk, olyan filtert kapunk, mely alkalmas pajzsmirigy betegségek diagnosztizálására. Az így előkészített filtert inkubáljuk a teszt-szérummal, vagy szérumhígításokkal. A szérumhígüásokat a blokkoló oldatban: 1 :10—1 :100 000-ig elkészítve titer állapítható meg. Ezután a felesleges, nem kötődött anyagot leöblítjük. A lekötődött antitesteket humán IgG-re, vagy IgM-re specifikus, peroxidázzal konjugált antihuman immunglobulinokkal detektáljuk és utolsó lépésként a reakciót előhívjuk hidrogénperoxid és megfelelő festék, célszerűen 4-klór-l-naftol segítségével. A szérumban jelenlévő specifikus antitestek esetén a reakció pozitivitása az alkalmazott szubsztrát színében jelenik meg a fehér háttéren a felcseppentett antigén területén. A pozitív reakciót kék szín megjelenése jelzi 4-klór-l-naftol esetén. Amennyiben a filterre TSH receptor antigént viszünk, pozitív reakció esetén a szín megjelenése Basedow-kórra diagnosztikus. Különös jelentősége az eljárásnak, hogy terhes Basedow-kórosok esetén előre jelezheti a magzati Basedow-kórt. A Basedow-kór klinikai kezelésénél fontos az antitest jelenlétének követése a kezelés befejezési időpontjának, a kezelés módjának megválasztása és a betegség kiújulásának észlelése szempontjából. Amennyiben a filterre human thyreoglobulint, vagy pajzsmirigy mikroszóma antigént viszünk, pozitív reakció esetén a szín megjelenése 1 :100 szérumhígítás feletti titerben krónikus pajzsmirigy gyulladásra utal. A találmány előnye az eddig alkalmazott eljárásokkal, módszerekkel szemben: A vizsgálati eljárás nem igényel különleges felkészültséget, műszereket, izotóp laboratóriumot. Az eljárás jól reprodukálható. A vizsgálati eredmények a gyógyítás területén gyors és hatékony lépések megtételét teszik lehetővé az orvos számára. A találmány szerinti eljárás egyedi vizsgálatok elvégzését is lehetővé teszi, szemben a RI A kitek meghatározott, 50—100 vizsgálati számával. Kiküszöbölhetők a szérumminták különböző időtartamú tárolásából adódó hibalehetőségek. Az eljárás koncéntrációfüggű, melynek következtében meghatározható egyedileg is az antitestek titere, adott esetben a betegség aktivitása. A peroxidazzal kapcsolt második reagenssel az antitest típusa: IgG, vagy IgM is meghatározható. Az eljárás érzékenységénél és specifikusságánál fogva jól alkalmazható a tudományos és kutatómunka során. A találmány bemutatására az alábbi példa szolgál: Egy 4X4 mm-es területű Millipore típusú nitrocellulóze filtert desztillált vízben 5 percig mosunk, majd szobahőmérsékleten megszárítunk. A négyzetbe ezt követően 10 mikrogramm pajzsmirigy TSH receptor antigént cseppentünk. Ezután a filteren a felcscppentést szárítással stabilizáljuk. Az így megszárított filter száraz helyen tárolható, az antigén reakcióképessége nem csökken. Ezután a filtert TRIS-Buffer-Salineben (TBS), mely 50 millimól TRIS-HCL, 200 millimól NaCl, pH 7,4 nedvesítjük. A blokkolást 5 % bovin szérum albumin TBS-ben elkészített oldatával végezzük, úgy hogy 150 mikroliter blokkoló oldatot a színével felfelé lévő filterre juttatunk és 15 percig hagyjuk rajta, majd a filtert megszárítjuk. Az ebben a stádiumban lévő filterek jól tárolhatók huzamosabb ideig. Ezután az első reakciót végezzük el, melyben a szérum antitcstjei az antigénhez kötődhetnek. A tesztoldat 1 :10, vagy nagyobb szérumlúgítás blokkoló oldatban. 150 mikroliter tesztoldatot mérünk a filterre és szobahőmérsékleten rázatással inkubáljuk az anyagot. Az inkubációs idő kb. 4 óra. A tesztoldal leszívása után a filtert TBS-el mossuk, majd a blokkolást megismételjük. Ezt követően második reakciót végezzük el, melyben az antigénhez lekötődött saját antitesteket detektáljuk, 150 mikroliter blokkoló oldatban 1:1000 hígított, peroxidázzal konjugált, humán IgG-re specifikus antihumán immunglobulinnal. Az inkubációt 2 órán át végezzük, majd az oldatot leszívjuk, és a filtert TBS-el mossuk. A fentiek során nyert filter előhívását 4-klór-l-naftol és H202 oldatával végezzük. Az előhívó oldat 3 milligramm /milliliter 4-klór-l-naftol metil alkoholos oldata, + 0,01%, H202. Kék szín megjelenése azt jelzi, hogy a beteg széruma TSH receptor elleni antitestet tartalmaz és a beteg Basedow-kórban szenved. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás pajzsmirigy antigének elleni antitestek kimutatására, azzal jellemezve, hogy tisztított pajzsmirigy antigént 0,1 — 10 mikrogramm, vagy egy komplex antigént 1-100 mikrogramm mennyiségben nitrocellulóz filteren szárítással rögzítünk és a filter többi kötőhelyét blokkoljuk, ezután a beteg szérumával inkubáljuk, majd az. így kötődött antitesteket specifikus, peroxidázzal konjugált antihumán immunglobulinnal detektáljuk és a reakciót hidrogén-peroxid-oldat és festékanyag hozzáadásával előhívjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 10 15 20 25 30 35 40 4b 50 55 60 65 2
