195537. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás antraciklin-származékok előállítására
1 195 537 2 Ugyanezen közzétételi irat alapján a Streptomyces pufpurascens törzset (DSM 2658) ismert módon tápoldatban fermentáljuk, miközben 24 40 °C hőmérsékletet, 6,5-8,5 pH-jú közeget és aerob körülményeket biztosítunk, A leválasztott micellától extrakcíóval választjuk el az antraciklin vegyületeket (citorhodin). Az extrakció során például vizes acetonnal 3,5 pH-jú közegben extraháljuk, az acetont eltávolítjuk, és a vizes fázist 7,5 pH-jú közegben etil-acetátta! extraháljuk. A tenyészet szűrletét 7,5 pH-jú közegben, előnyösen etil-acetáttal extraháljuk. A micellából és a tenyészet szűrletből készített etil-acetát extraktumokat összeöntjük és száraz bepárlás után nyers maradék keletkezik. Előnyösen a maradékot éppúgy dolgozzuk fel, mint ahogy azt a német szabadalmi bejelentésben leírták. Eszerint a nyers maradékot tokióiban feloldjuk és acélát puffcrrcl (pH = = 3,5) extraháljuk, miközben egy toluolos, és egy vizes fázis keletkezik. A vizes fázist a következő módon tovább feldolgozzuk: A pH-t 7,5-re beállítjuk, majd ismételten etil-acetáttal extraháljuk és töményítjük az etil-acetát fázist, amikoris úgynevezett nyers citorhodin keveréket kapunk, amelyből a (II) általános képletű antraciklin-származékokat (citorhodinokat) kromatográfiai úton elválasztjuk. A (II) általános képletű kiindulási vegyületeket — a képletben R jelentése“hidroxilcsoport, R3 és R4 jelentése a már megadott - (a 34 25 357.2 számú német szabadalmi bejelentés szerint) az előbbiekben leírt eljáráshoz hasonlóan állítjuk elő, csak azzal a különbséggel, hogy a fermentációt megnövelt levegőztetési rátán 0,8- 1,2 térf./térf. és 70-130 óra, előnyösen 90-110 óra alatt folytatjuk le. A találmány tárgyát közelebbről megvilágítják a következő példák. A példákban közölt „U” az enzim aktivitásra nemzetközileg elfogadott mértékegység (U = 1 jumól szubsztrátunr átalakítása percenként és 1 mg proteinként) rnU = milliegység. 1. példa Oxidoreduktáz elválasztása az ATCC 31 133 számú Streptomyces galilaeus törzstől Az ATCC 31 133 Streptomyces galilaeus törzset spóraszuszpenzióként átoltottuk egy 2000 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 500 ml tápoldatba. A tápoldat Összetétele a következő volt: oldódó keményítő 15 g glükóz 10 g szójaliszt 10 g élesztőextraktum 1 g K2HP04 1 g NaCl 3 g desztillált víz 1 I pH 7,4 A spóraszuszpenziót 48 órán keresztül inkubáltuk 28 °C hőmérsékleten és 200 ford/perc fordulatszámú rotációs rázógépen. Ebből az előtenyészetből 900 ml-t alkalmaztunk oltóanyagként egy 9 liter tenyész-oldattal megtöltött 12 literes fermentorban. A tenyészoldat összetétele a következő volt: oldódó keményítő 15 g glükóz 10g szójaliszt 30 g élesztő extraktum 1 8 kh2po4 1 g MgS04X7H20 1 g NaCl 1 g nyomelemek 1 ml desztillált víz 1 1 pH 7,4 nyomelemeket tartalmazó oldat: CoCl2X6H20 0,25 g NíCI2X6H20 0,01g CuC!2X 2H20 0,01 g ZnCI2 0,1 g H3BO3 (bórsav) 0,5 g Na2Mo04X2H20 0,3 g NaSe03X3H20 0,1 g FeS04X7H20 0,2 g pH-t 2—3-ra állítjuk be sósav oldattal EDTAÍTitiiplex(III)] 0,05 g desztillált viz 1 1 Három-négy napig, 28 °C hőmérsékleten, 400 ford/ /perc fordulaton és 0,5 térf./térf. levegőztetési ráta mellett végzett fermentáció után kinyerjük a tenyészoldntot, centrifugáljuk és a tenyészet szűrletét tízszeresére sűrítjük. Á sűrítményhez 50%-os telítettségig ammónium-szulfátot adunk, a felülúszót elöntjük, az üledéket pedig feloldjuk 7,4-es pH-jú (10 minői) Trisz- HCl-pufferban és az elegyet ugyanilyen, 100-szoros térfogatú pnferral szemben dializáljuk. Az enzim oldatot ezután összekeverjük DE 52 anioncserélővei (Whatman), a nem kötődött fehérjéket a már megadott puferral végzett mosással eltávolítjuk, miközben a pufferhez 20 mmól/l NaCl-t adunk, majd ezt követően az oxidoreduktázt ugyanezzel a pufferral 250 mmól/l NaCl hozzáadagolása közben eluáljuk és 80%-os ammónium-szulfáttal végzett kicsapással koncentráljuk az elegyet. A keletkezett 130 mU/mg fehérjét tartalmazó enzim o!datot liofilizáljuk és —18 °C hőmérsékleten tároljuk. Az oxidoreduktáz aktivitásának mérését a citorhodin B szubsztráttal keletkező H202 mérésével végezzük. A H202-t, egy csatolt reakcióban peroxidázzal átvisszük az o-fenilén-diaminra és a keletkező sárga színanyag koncentrációja egyenesen arányos az enzim által keletkezett H202 mennyiségével. 2. példa Oxidoreduktáz készítmény előállítása Streptomyces purpurasccns DSM 2658 törzsből A DSM 2658 Streptomyces purpurascens törzset a következő összetételű élesztő-maláta-garra tesszük: malâtaextraktum 10 g élesztőextraktum 4g glükóz 4g agar 15 g desztillált víz 1 1 pH 7,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
