195536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 195 556 2 leírásban, vagy a 0 046 284 sz. nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben található. Ezen mikroorganizmus törzsek, valamint az eló'bb leírtak mintái a Fermentation Research Institute, Yatabe, Japán, és/vagy az American Type Culture Collection. Maryland, U.S.A. intézeteknél találhatók letétben, és ezekről a letéti helyekről a Budapesti Egyezmény rendelkezései értelmében beszerezhetők. Az IFO számmal jelzett mikroorganizmusok az Institute of Fermentation, Osaka, Japán, intézettől is beszerezhetők. Bár a táptalajhoz hozzáadandó 2.5-dikcto-D-gliikonsav mennyisége és a hozzáadás módja az alkalmazott mikroorganizmustól, és a táptalaj, és a tenyésztés körülményeitől függően változik, az említett savat általában egyszerre vagy időszakosan adagolva adjuk a táptalajhoz, vagy a fermentléhez 1 — 10% összesített koncentrációnak megfelelően. Az említett sav mennyisége minden egyes időszakos adagolásnál előnyösen 0,05—2% koncentrációnak megfelelő mennyiség a táptalaj, vagy a fermentlé összes mennyiségére számítva a beadagolás időpontjában. A táptalaj vagy fermentlé pH-ját általában 5,0—9,0, és előnyösen 6,0-8,5 között tartjuk az átalakítás közben lúgos anyagok, például kalcium-karbonát óvatos adagolásával. Más módszer szerint valamilyen alkalmas puffer is adható a táptalajhoz a tenyésztés kezdetén. Ezek a körülmények a jelen találmány más megvalósításaira is alkalmazhatók a megfelelő leírásban való bizonyos módosításokkal, (3) Nitrát só és hidrogéndonor alkalmazása a tenyésztésben. A 2-keto-L-gulonsavnak 2,5-diketo-D-glükonsavból 2-keto-D-glükonsav egyidejű felhalmozódása nélkül a (II) mutáns alkalmazásával való előállítása megvalósítása során a feltalálók azt észlelték, hogy a 2-keto-L-gulonsav termelése jelentékenyen megnő, és a 2-keto-L-gulonsav 2,5-diketo-D-glükonsavból való molekuláris kitermelése is jelentősen javítható, ha nitrátot adnak a (II) mutáns tenyésztésére szolgáló elegybe, és/vagy ahhoz a táptalajhoz, amelyben a (II) mutáns hat a 2,5-diketo-D-glükonsavra, és ha a 2,5-diketo-D-glükonsav adagolásával egyidejűleg valamilyen hidrogéndonort adnak a fermentléhez, és ezen észleletek alapján ezt a jelen találmány második lényeges jellemzőjének tartják. Ha a (II) mutánst 0,1-0,5% nitrát adalékot tartalmazó táptalajra oltjuk, és ezen tenyésztjük, a (II) mutáns növekedése a tenyésztés kezdete utáni 10—24 órában éri el maximumát. Továbbá a nitrátot a táptalajhoz 0,05— 0,5% koncentrációban adjuk olyan fázisban, amikor a növekedés eléri maximumát, vagy ezután a fázis után 10 órán belül. Az eljárás során alkalmazható nitrátok alkálifémsók, például kálium-nitrát és nátrium-nitrát, alkáliföldfémsók, például kalcium-nitrát és magnéziumnitrát, továbbá mangán-nitrát. A nitrát a (II) mutáns tenyésztésének kezdetén adható a táptalajhoz. Az adagolás végezhető a 2,5-diketo- D-glükonsav hozzáadásával egyidejűleg egyszerre, vagy a betáplálással párhuzamosan adagokban. Ajánlatos a tenyésztés kezdetén, és a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálás kezdetén végrehajtani. Azt is tapasztaltuk még, hogy a nitrát-adagolásnak tulajdonítható javulás még jelentősebb lesz, ha a 2,5-diketo-D-glükonsav betáplálással egyidejűleg valamilyen hidrogendonort is adunk a táptalajhoz. Tehát a 2-kcto-L-gulonsav-tcrmelés jelentősen növelhető valamilyen hidrogéndonor hozzáadásával is. Hidrogéndonorkcnt bármely szénhidrát és polihidroxi-alkohol alkalmazható, amennyiben a törzs hasznosítani tudja ezeket. Ajánlatos, ha a hidrogéndonort a 2,5-dikcto-D-güikonsav betáplálással egyidejűleg adagoljuk a 2,5-diketo-D-glükonsawal kombinálva. Bár a hidrogéndonor koncentrációja változhat a 2,5- diketo-D-glükonsav adagolásának körülményeitől, és az alkalmazandó mutánstól vagy a fermentlétől függően, amelyben a mutánst iukubáljuk, a hidrogéndonort általában a betáplálandó 2,5-diketo-D-glükonsav mennyisége 5—50%-ának megfelelő koncentrációban adjuk a fermentléhez. A nitrátnak a találmány szerinti hozzáadása által elérhető javulás annak a ténynek tulajdonítható, hogy a nitrát részt vesz a hidrogéndonerként hozzáadott szénhidrát vagy szerves sav mikroorganizmus sejtek által való mstabolizálásában. Aktiválja a 2,5-diketo-D-glükonsav 2-keto-L-gulonsavvá való redukciós rendszerét a mikroorganizmus sejtekben, és a hidrogéndonorból felszabadított hidrogént a redukciós rendszerhez juttató szerepet játszik. A hidrogén donor hozzáadása nélkül a nitrát egyedüli hozzáadásának hatása csekély befolyással lenne a 2-keto-L-gulonsav termelésére; azaz a nitrátsó beadagolás javító hatása a termelés növekedésére és a 2-keto- L-gulonsav magas kitermelése lényegesen fokozható a hidrogéndonor jelentős adagolásával. Az előbb leírt előnyökön kívül a nitrát adagolás hatásos a fermentlé előírt pH-értékének (6,5—8,0) ismételt fenntartásában is, amely előnyös a 2-keto-L-gulonsav 2,5-diketo-D-glükonsavból való termelésére. Összegezve az állapítható meg, hogy a nitrát a hidrogéndonor mikroorganizmus által való metabolizálásának javítására szolgál, és inkább a redukciós rendszer aktiválásában és stabilizálásában játszik szerepet, mint a mikroorganizmusok által nitrogénforrásként való hasznosításában. Általában egy nitrogéntartalmú vegyület hasznosítható nitrogénforrásként való hatását a sejtkoncentráció növekedésében értékelhetjük. Hasonló szervetlen vegytíletek közül egy ammóniumsónak sokkal nagyobb hatása van erre a növekedésre, mint a nitrátnak. Az ammóniumsó a sejtkoncentráció növekedésére akkor hatásos, ha a tenyésztés kezdetén adjuk a fermentléhez, vagy a 2,5- diketo-D-glükonsav betáplálás idején, de csak kis hatása van a 2-keto-L-gulonsav termelés fokozására. Ezzel ellentétben a nitrátnak kisebb hatása van a sejtkoncentráció növekedésére, mint az ammóniumsónak, de közrejátszik a 2-kcto-L-gulonsav-termelés jelentős növekedésében. Ezeket a hatásokat a példákban később szemléltetjük. (4) A 2,5-diketo-D-glükonsav fermentlé sterilizálása felületaktív anyaggal. 2-Keto-L-gulonsav ipari méretű előállításának megvalósítása során a feltalálók megkísérelték, hogy úgy állítsanak elő hatásosan 2-keto-L-gulonsavat, hogy a (111) törzs tenyésztésével kapott 2,5-díketo-D-glükcnsav fermentlevet [amely milliliterenként 108—I0t0 élő (III) sejtet tartalmaz] táplálták be közvetlenül a (II) mutáns tenyészetébe. A kísérleti eljárás során azt tapasztalták, hogy az (I) szülőtörzs esetétől eltérően, ha a (11) mutánst alkalmaz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
