195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
1 195 535 2 állított szarvasmarha agyalapi mirigyből származó P32-jelzett cDNS-se! szemben, ahogy azt Grunstcin és Ilogncss leírja (lásd előbb). A kiválasztott telepekből izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, Pst I enzimmel hasítjuk, 1 % agarózzal készült gélen elektroforézisnek vetjük alá, etidium-bromiddal festjük és lefényképezzük, végül Southern módszerével (lásd előbb) nitrocellulóz szűrőn szűrjük. A növekedési hormont meghatározó szekvencia jelenlétét a transzformált dezoxiribonukleinsavban klónozott teljes hosszúságú patkány hormont meghatározó cDNS molekulákkal szembeni hibridizációval bizonyítjuk (Seeburg és munkatársai, mint fent); a jelzést úgynevezett „nick” transzlációval végezzük [Maniatis és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 72, 1184 (1975)]. Egy olyan kiónt kaptunk, amely hibridizálődik a niek-Irans/laíáll dezoxi-ribonukleinsavval, ezt pBP348-nak neveztük el. A beépített szakasz 831 bázispárt tartalmaz. 2. példa A cDNS szekvencia-analízise A pBP348 plazmidot Pst I enzimmel hasítjuk, és a DNS fragmensek 5’-végeiről alkalikus foszfatázzal eltávolítjuk a foszfátcsoportokat és polinukleotid-kináz enzim segítségével P -foszfátcsoportokkal helyettesítjük. Ezután több, más restrikciós endonukleázzal hasítunk, poliakriiamíd gélen elektroforézist végzünk, megfestjük a lemezeket, és a dezoxi-ribonukleinsav csikókat autoradiográfiával hívjuk elő. Ily módon megkapjuk a klónozott dezoxi-ribonukleinsav restrikciós térképét. Ezután nagymennyiségű pBP348-at állítunk elő, és Pst I, Pvu II vagy Sau 3A enzimmel hasítjuk, P32-t tartalmazó ATP-vel jelezzük polinukleotid-kináz segítségével, majd más enzimekkel is hasítjuk, amiután égyszálú végekkel rendelkező dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket kapunk. Ezeket poliakrilamid gélről eluáljuk, és Cooke és munkatársai (lásd előbb) és Maxam és Gilbert szerint ÍProc. Nat. Acad. Sei., USA, 74, 1560 (1977)] szekvencia-analízist végzünk. Az 1. ábrán megadjuk a beépített cDNS szekvenciáját az élő szál által meghatározott, megfelelő aminosav-sorrenddel együtt; az úgynevezett élő szál megfelel a megfelelő mRNS szekvenciájának. Azt a tényt, hogy a beépített szakasz megfelelő leolvasási fázisban van, úgy ismerjük fel, hogy a beépített szakaszok jelentős részéből hiányzik a terminációs kodon. Az aminosavak helyzetét a szarvasmarha növekedési hormon amino-terminális aminosavától kezdődően számozzuk, a számozást pozitív irányban a karboxil-terminális vég felé folytatjuk, negatív irányban pedig az első AUG kodonig; ez megfelel a transzláció kezdetét meghatározó pontnak. A szekvencia szerint, mint ahogy az más hormonok esetén is felismerhető, a növekedési hormon szintézisében poszttranszlációs folyamatok is szerepet játszanak. A növekedési hormon mRNS-ének transzlációja során egy prekurzor jön létre, a növekedési prehormon, amely szignál pepiidet tartalmaz, és amely az endoplazmatikus retikulumba vándorol. 3. példa A) Az 1. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pBR322 plazmid helyett pBR315 plazmidot használunk. Az összes reakció, így a rekombináns kiónok szelekciója is, az előzőekben megadottak szerint történik. A beépített szakaszt kihasítjuk, és a 2. példában megadottak szerint eljárva analizáljuk, amikor az 1. ábrán megadott szekvenciájú, 831 bázispáfból álló dezoxi-ribonukleinsavat kapunk. B) Az 1. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pBR322 plazmid helyett pBR3I6 jelű plazmidoí használunk. Az összes reakciókörülmény az 1. példában megadottal azonos. A beépített szakaszt kihasítjuk, és a 2. példában megadottak szerint analizáljuk, amikor olyan dezoxi-ribonukleinsavat kapunk, amely az 1. ábrán megadott szekvenciájú. 4. példa Előállítjuk a szarvasmarha előnövekedési hormont meghatározó cDNS molekulát az 1. példában megadottak szerint eljárva. Az összes, a példa során használt restrikciós hely linker, és az összes többit Scheller és munkatársai módszere szerint állítjuk elő [Science, 196, 177 (1977)]. A példa során használt restrikciós endonukleázok és az összes többi beszerezhető áz alábbi helyen: New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Az enzimeket a gyártó javaslatai alapján használjuk. Az E. coli K 1776 sejteket az), példában megadottak szerint transzformáljuk. A) Az 1. példában megadott módon előállított cDNS molekulákhoz hozzákapcsoljuk az 5’-CCAAGCTTGG-3' szekvenciájú Hind III linkereket. A kapcsolást T4 dezoxi-ribonuklcinsav-ligázzal végezzük Valenzuela és munkatársai módszere szerint [Nature, 280, 815 (1979)]. A ligációt követően a terméket Ullrich és munkatársai szerint [Science, 196, 1313 (1977)] Hind III vagy Hsu I enzimmel emésztjük, A pBR322 plazmidot a Hind III restrikciós helyen vagy 1 lind MI, vagy Hsu I enzimmel hasítjuk, majd ezt követően alkalikus foszfatázzal kezeljük, ahogy azt Ullrich és munkatársai (lásd előbb) leírják. Etanolos kicsapást követően a foszfatázzal kezelt, hasított pBR322-t Hind III kohézív végeket tartalmazó cDNS-hez kötjük, ahogy azt Ullrich és munkatársai (lásd előbb) leírják. A ligációs keverékkel E. coli k 1776 sejteket transzformálunk, és a transzformált telepeket tetraciklin-érzékcnység alapján szelektáljuk. A klónozott dezoxi-ribonukleinsav jelenlétét az 1. példában megadottak szerint határozzuk meg. Egy olyan telepet kaptunk, amely „nick”-transzlatált dezoxi-ribonukleinsavval hibridizálódó, beépített szakaszt tartalmaz. Ezt Hind III vagy Hsu I enzimmel emésztjük, és a 2. példában megadottak szerint eljárva analizáljuk. A beépített szakasz 830 bázispárt tartalmaz, és az 1. ábrán megadott szekvenciájú. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
