195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
I 195 535 2 II. Táblázat Transzfer vektor Egyedülálló restrikciós helyek pSClOl EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI, Hpa 1, Sma I pMB9 EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI pBR313 EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI, Hpa I, Sma I, Xma I pBR315, pBR322 EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI, Pst 1 pBR316 Hind 111, Sal I, Bam HI, Pst I pC194 Hind III Charon 16A EcoRI, Sst I Charon 3A EcoRI Charon 4A EcoRI lambda gtWES • ■ lambda B EcoRI. Általában úgy járunk el, hogy a cDNS molekulát a könnyű szelektálás érdekében egy fenotípusos szakaszban lévő restrikciós helyre építjük be. Így például a Hind III, Sal I és a Bam Hl restrikciós helyek a pSClOl, pMB9, pBR313, pBR315, pBR316 és pBR322 vektorokban a tetraciklin rezisztenciáért felelős génen, vagy ennek a szabályozó szakaszán belül esnek. Ha arra a helyre építünk be, úgy a tetraciklin rezisztencia elveszik. A cDNS molekulát transzfer vektorokba restrikciós linkerek vagy dezoxi-nukleotjd-pótlók segítségével építhetjük be. Az első esetben egy adott restrikciós endonukleázt, például a fentiekben ismertetett egyik enzimet felismerő pontot tartalmazó,' szintetikus nukleotidot kapcsolunk a cDNS molekulához. A cDNS-t és a transzfer vektort külön-külön inkubáljuk a restrikciós endonukleázzal, majd összekeverjük, amikor a cDNS szekvenciát tartalmazó transzfer vektorhoz jutunk. A második esetben a cDNS molekulát dezoxi-nukleotiddal és terminális transzferázzal kezeljük, ahogy azt Roychoudhury és munkatársai leírják [Nucl. Acids Res., 3, 863 (1976)]. A restrikciós endonukleázzal való emésztés után a transzfer vektort kiegészítő dezoxi-nukleotidokkal látjuk el a fentiekhez hasonló módszerrel. Ezután a kiegészített transzfer vektort, és az ugyancsak kiegészített cDNS molekulát összekeverjük, amiután olyan transzfer vektort kapunk, amely tartalmazza a cDNS-t. Például úgy járunk el, hogy a cDNS molekulához dC-szakaszt kapcsolunk, a transzfer vektort felnyitjuk a Pst I ponton, és dG-szakaszt kapcsolunk hozzá. A cDNS-t tartalmazó transzfer vektort ezután megfelelő gazdasejtbe transzformáljuk. A különböző transzfer vektorokra használható gazdasejtek között megemlítjük az E. coli-t, a B. subtilis-t, élesztőket, az N. crassa-t, és a szövettenyészetben lévő állati sejteket. A fenti gazdák transzformálására képes transzfer vektorokat az előzőekben ismertettük. E coli-ként általában három mutánst használnak. Ezek: k 1776, RRI és HB101. Az E. coli K 1776 törzset Curtis írja le [Ann. Rev. Microbiol., JO, 507 (1976) és leírását megtaláljuk a 4 190 495 sorszámú amerikai szabadalmi leírásban]. Az E. coli RRI törzset Dugaiczyk és munkatársai közlik [Molecular Mechanisms in Control of Gene Expression at, 543. oldal. Az E. coli HB 101 törzset Kedes és Thomas Írja le, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 73, 1537 (1976)]. A megfelelő gazdasejtet hmert módszerekkel transzformáljuk. Például az E. coli k 1776 törzset cDNS molekulát tartalmazó transzfer vektorral Cookc és munkatársai szerint [J. Biol. Chem., 255, 6502 (1980)] transzformáljuk. A telepeket ismert technikák szerint szelektáljuk és/vagy szűrjük ki. A telepeket például fenotípusos tulajdonságok, például tetrac klin-rezisztencia elvesztése alapján választjuk ki. Kiszűrhetjük a telepeket az alábbiak szerint is: 1) Megfelelő restrikciós endonukleázzal kezelve eltávolítjuk n cDNS-t, és clektroforézissel és hibridizációval analizáljuk [Southern, J. Mól. Bioi., 98, 503 (1975)]; vagy 2) Grunstein és Hogness módszere szerint [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 72, 3961 (1975)] replikázzuk, és megfelelő próbával hibridizáljuk; végül eljárhatunk úgy,hogy 3) a telepeket közvetlenül vizsgáljuk,hogy megtartódik-e a sejtekben a kifejeződés (RIA vagy más technikákkal). A szarvasmarha növekedési hormont meghatározó dezoxi-ribonukleinsav előállítására felhasználhatjuk a szarvasmarha növekedési prehormont meghatározó DNS-be beépített szakaszt. A prehormont meghatározó dezoxiribonukleinsavat megfelelő restrikciós endonukleázzal eltávolítjuk. így például, ha a cDNS-t a pBR322 plazmidba építettük be a Pst I helyre, úgy a cDNS egy részét Pst I részleges emésztéssel távolíthatjuk el, mivel a szarvasmarha növekedési hormont meghatározó cDNS két Pst I helyet tartalmaz. Ezután Hae II enzimmel emésztjük a cDNS-t. Eljárhatunk oly módon is, hogy a pBR322 plazmidból származó rekombináns plazmidot a beépített cDNS egy részének eltávolítására Hae II enzimmel emésztjük. A Hae II enzimmel való emésztéskor kihasad az N-terminális szignál-pepiidet meghatározó dezoxi-ribonuklcinsav, és két vagy három olyan bázis, a mely a növekedési hormon N-terminális alaninját határozza meg. A bázisokat ezután oly módon pótoljuk,hogy a dezoxi-ribonukleinsavat a DNS-polimeráz I Klenow- Tagmensével és dezoxi-nukleotidokkal inkubáljuk. Az alanint meghatározó bázisokat kihasíthatjuk oly módon is, hogy a cDNS molekulát Klenow-fragmenssel, T4 fiNS-polimerázzal vagy S’-ó’-exonukleázzal kezeljük dATP jelenlétében. A Klenow-fragmenst Klenow és Henningsen írta le [Proc. Nátl. Acad. Sei., USA, 65, 168 (1970)]. A növekedési hormont meghatározó cDNS-t ezután megfelelő transzfer vektorba építjük be, a fentiek s rennt. A klónozott dezoxi-ribonukleinsavat baktériumban fejezzük ki, amikor vagy a beépített szakasz által meghatározott szarvasmarha növekedési hormont tartalmazó fúziós proteint, vagy magát a szarvasmarha növekedési hormont kapjuk meg. Több lehetséges technikát alkalmazhatunk, ezek közül megemlítjük: a) a meghatározó szekvencia módosításával a megkívánt, pontos transzlációs startpont kialakítása; b) optimális kifejeződő vektor kiválasztása vagy előállítása; I c) transzlációt követő beavatkozás, vagy in vivo a sejt aktivitásának kihasználásával, vagy in vitro, kémiai módszerekkel; végül d) direkt kifejezés. lia a kifejeződést követően Túziós proteint kapunk, 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
