195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
1 195 535 2 AAGTGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGC TGT GCC TTC TAG - 3', ahol A dezoxi-adenilcsoport, G dezoxi-guanilcsoport, C dezoxi-citozilcsoport, és T timidilcsoport. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint a szarvasmarha pre-növekedési hormonjának szekvenciáját tartalmazó plazmidként pBP348 plazmidot használunk, és egy transzfer vektor restrikciós enzimmel való hasításával előállított DNS molekula a pBR322 jelű molekula, és a restrikciós enzim a Pst I. A találmány egy további előnyös kivitelezési változata szerint a szarvasmarha növekedési hormonjának szekvenciáját tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására úgy járunk el, hogy a szarvasmarha növekedési hormonját meghatározó szekvenciát tartalmazó dezoxinukleotidot egy olyan dezoxi-ribonukleinsav molekulával reagáltatjuk, amelyet egy transzfer vektor restrikciós enzimmel való hasításával állítottunk elő. Egy további előnyös kivitelezési változat szerint egy kifejeződő transzfer vektor előállítására úgy járunk el, hogy egy restrikciós enzimmel hasított transzfer vektorból származó DNS molekulát egy kifejeződő szabályozó szakasz egy pontján hasítjuk. A találmány szerinti eljárás egy további előnyös kivitelezési változata szerint a szarvasmarha pre-növekedési hormonjának megfelelő aminosav-szekvenciát vagy a szarvasmarha növekedési hormonjának megfelelő aminosav-szekvenciát a C-terminális végen tartalmazó és az N-terminális végen egy prokarióta proteint tartalmazó fúziós protein előállítására úgy járunk el, hogy egy, a szarvasmarha pre-növekedési vagy növekedési hormonját meghatározó dezoxi-nukleotid-szekvenciát tartalmazó kifejeződő transzfer vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk. A találmány egy további előnyös kivitelezési változata szerint szarvasmarha növekedési hormon szintézisére úgy járunk el, hogy a szarvasmarha növekedési hormonját meghatározó dezoxi-nuklcotid-szckvcnciát tartalmazó kifejeződő transzfer vektorral transzformált mikroorganizmust tenyésztünk olyan körülmények között, ahol a szarvasmarha növekedési hormont meghatározó szekvencia kifejeződik, majd a szarvasmarha növekedési hormonját a sejtek lizátumából, vagy a tenyészetből elkülönítjük. A növekedési hormon egy polipeptid hormon, amely az adenohipofizis (az agyalapi mirigy elülső lebenye) sejtjeiben szintetizálódik, és onnan szekíetálódik. A növekedési hormon prekurzor proteinként (pre-növekedési hormon) szintetizálódik, ez a vegyület N-terminális szignál peptidet és magát a növekedési hormon szekvenciát tartalmazza. Az aminosav-szckvcncia a szarvasmarha növekedési hormon esetében ismert [Dayhoff és munkatársai, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5. kötet, 3. fejezet, 245-352. oldal, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C. (1978)]. A növekedési hormon normális körülmények között az egész élet folyamán keletkezik, bár legnagyobb mennyiségben serdülőkorban. A hormon a serdülőkori növekedéshez szükséges. Bár hatásmechanizmusa részleteiben nem ismert, úgy tudjuk, hogy a növekedési hormon elősegíti a csontnövekedést, a nitrogén-visszatartást, a protein-szintézist és befolyásolja a glükóz, és a lipid mctnbolizmusát. Más szavakkal, a növekedési hormon általános anabolikus szer. A szarvasmarha növekedési hormonjának használata a fentiek során részletezett biológiai aktivitásokon alapszik. A szarvasmarha növekedési hormont borjaknak adagolhatjuk növekedésük elősegítésére és súlyuk gyarapítására, ezáltal csökkentjük a születés és az állat eladása közötti időt. A húshozam növekedése jelentős lehet. Ezenkívül a szarvasmarha növekedési hormonja csak néhány aminosavban különbözik a juhokétól. így a szarvasmarha növekedési hormonját hasonló célok elérésére adagolhatjuk a juhoknak is, azaz növelhetjük a növekedés és a súlyhozam mértékét; így növelhetjük a hústermelést. Lehetséges ezenkívül az is, hogy a szarvasmarha növekedési hormonját sertéseknek vagy más állatoknak is adagolhatjuk a fenti célok elérése érdekében. Dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák klónozásának alapmódszerei már ismeretesek. így például Seeburg és munkatársai [Nature, 270, 486 (1977)] leírják a patkány növekedési hormonját meghatározó gén klónozását; Shine és munkatársai [Nature, 270, 494 (1977)] ismertetik á humán szomatomammotropin gén klónozását; Derynck és munkatársai pedig [Nature, 285, 542 (1980)] ismertetik a humán fíbroblaszt interferon génjének klónozását. Ma már ismeretesek a heterológ dczoxi-ribonukleinssvak mikroorganizmusokon való kifejezhetőségének módszerei. Lényegében úgy járunk el, hogy a heterológ kódoló DNS-szekvenciát egy DNS transzfer vektorba építjük be olyan ponton, amely egy kifejezhető operonon belül esik. Hibrid protein előállítására a szekvenciát az ooeron meghatározó szekvenciájának megfelelő leolvasási fázisba kell beépíteni, és a transzlációnak megfelelő irányba kell orientálnunk. Ha ezek a feltételek teljesülnek, úgy az operon transzlációjakor bekövetkezik a beépített meghatározó szekvencia leolvasása is, így olyan úgynevezett fúziós protein keletkezik, amely N-termináiis aminosav-szekvenciaként a kifejeződő operon által meghatározott részt tartalmaz, majd ez titán a beépített szakasz által meghatározott aminosav-sorrendű szakasz következik [erre vonatkozóan lásd Polisky és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 73, 3900 (1976), Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1979)]. Kifejeződő operonként több operont használnak, közöttük a 0-galaktozidáz, a /3-laktamáz és a triptofán operonját. A leírás során használt rövidítések a szakember számára érthetőek. Ezeket a rövidítéseket a J. Biol. Chem. elfogadta. A találmány tárgya eljárás a szarvasmarha pre-növekedési vagy növekedési hormonját meghatározó, dezoxiribonukleinsav klónozására, és a klónozott DNS kifejezésére mikroorganizmusokban. A szarvasmarha pre-növekedési hormonját meghatározó mRNS-t a szarvasmarha agyalapi mirigyéből izoláljuk. A mRNS-ből reverz transzkriptázzal egy cDNS másolatot készítünk; ezt ezután egy transzfer vektorba építjük be. A szarvasmarha növekedési hormonját meghatározó dezoxi-nukleotid-szekvencia előállítására a szarvasmarha pre-növekedési hormonjának megfelelő cDNS molekuláról hidrolizáljuk az úgynevezett pre-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
