195535. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarha növekedési hormont vagy prehormont meghatározó bázis sorrendet tartalmazó DNS transzfer vektor előállítására
1 195 535 2 zuk radioaktivitását. A kísérlet szerint a fúziós fehérje bizonyos szarvasmarha növekedési hormon immunaktivitást köt meg. A fúziós protein további termelésének szemléltetésére minisejt-kísérletet végzünk Meagher és munkatársai szerint [Cell, 10, 521 (1977)]. A 2. ábrán mutatjuk be az E. coli k 1776 minisejtekkel kapott gélelektroforézis képét. Az a csík a pBP348 plazmiddal transzformált k 1776 sejtekből származik. A b csíkot a pBR322-vcl transzformált k 1776 sejtek vizsgálatakor kaptuk. A c molekulasúly-kontroll. Az A jelzi a /3-laktamáz és a szarvasmarha növekedési előhormon fúziós termékét. A 5-vel jelöljük a prelaktamáznak megfelelő csíkot, és C-vel a /Maktamázt. A kísérlet szerint a pBP348 olyan fúziós protein szintézisét határozza meg, amely 183, /Maktamázhoz tartozó aminosavat, 217, a szarvasmarha növekedési clőhorinophoz tartozó aminosavat, és néhány, a közönséges körülmények között nemíranszlatált 5'-szakasz által meghatározott aminosavat tartalmaz. A termék molekulasúlya közelítőleg 45.000, ez megegyezik az clőrejelzett hibrid fehérje molekulasúlyával. B) A szarvasmarha növekedési előhormonjának közvetlen kifejezésére a beépített dezoxi-ribonukleinsavat először elválasztjuk a pBP348-tól, az elválasztást Pst I endonukleázzal kivitelezett részleges emésztéssel végezzük, és a terméket preparatív gél-elektroforézisscl tisztítjuk. 15 jug mennyiségű tisztított, előzőleg beépített dezoxiribonukleinsavat vízben szuszpendálunk, a szuszpenzióhoz tömény só-oldatot adunk, amelynek összetétele az alábbi: 70 mmól Trisz (pH = 8,8), 70 mmól magnézium-klorid, 10 mmól ditio-treitol és 13,75 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz. A reakcióelegy teljes térfogata 250 pl, a koncentrációk vég-térfogatokat jelentenek. A reakcióelegyet néhány percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, majd az endonukleotikus emésztésnek a következő adeninen való leállítására 50 mmól vég-térfogatban dATP-t adagolunk. 30 másodperc múlva tovább folytatjuk az inkubációt, majd az enzim inaktiválására néhány percen át 65 °C hőmérsékletre hevítjük. Ezt az eljárást kétszer megismételjük, először a dATP helyett dCTP-t használunk, majd dTTP-vel fejezzük be. A kezelt dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el. Sl-nuklcázzal való emésztést követően úgynevezett tompavégű molekulákhoz jutunk (lásd Ullrich és munkatársai, mint előbb). A kezelések után olyan dezoxi-ribonukleinsav-inolekulát kapunk, amely 26. helyen a start kodonnál hasadt. Ezeket a molekulákat transzlatálhatjuk olyan expressziós vektorba beépítve, amely 3—11. nukleotidnak megfelelő beépíthető helyet tartalmaz a riboszónta kötőhelynek megfelelő szekvenciától számítva. A ptrpE30 plazmid módosításával közvetlen kifejezésre alkalmas vektort készítünk oly módon, hogy T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal és Sl-nukleázzal a fentiek szerint eljárva kihasítjuk a 23-29. nukleotidot. A módosított cDNS-t és a módosított expressziós vektort specifikus, S'-CCGGATCCGGS'-szekvenciáva! rendelkező, specifikus linkerrel látjuk el az egyik szálon, a másik szálra pedig a komplementer szekvenciát építünk be; a kötőmolckulák beépítése vég-ligációval történik dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, ahogy azt Valenzuela leírja (lásd előbb). A linkerek Bam Hl endonukleázra érzékeny restrikciós helyeket biztosítanak, ezt felhasználjuk a beépítéskor. A beépítést Ullrich és munkatársai szerint (lásd előbb) végezzük. E. coli HB101, RRI vagy k 1776 gazdabaklériumot transzformálunk a beépített, módosított növekedési előhormont meghatározó szakaszt hordozó rekombináns vektorokkal, és a transzformánsokat ampicillin rezisztenciára szelektáljuk. További analízisre ptrpE30/bGH jellel jelzett transzformánst Izolálunk. A ptrpE30/bGH-val transzformált baktériumsejteket standard M9 jelű minimál táptalajon tenyésztjük, a táptalajt Icucinnnl, prolinnal. B1 vitaminnal és ampicillinnel egészítjük ki. A Iciiyésztést 37 °C hőmérsékleten végezzük. A korai log-fázisban a trp operont 30 pg/ml táptalaj i0-indoli!-akrilsav adagolásával indukáljuk. A kontrolitenyészetet nem indukáljuk. Három további órán át folytatjuk 3 tenyésztést, majd 1,5 ml sejttenyészetet 20 pCi S35 -L-metionin adagolásával radioaktívan jelzünk, és további 10 percen át inkubálunk. Centrifugálással összegyűjtjük a sejteket, mossuk, és 250 ;d alábbi összetételű pufferben szuszpendáljuk: 10% glikol, 5% |3-merkapto-etanol, és 2,3% nátrium-dodecil-szulfát 0,0625 mól Trisz-ben (pH = 6,8). 5 percen át forraljuk a szuszpenziót, majd ezután 10% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó poliakrilamid gélre juttatjuk, és elektroforézissel fiakcionáljuk. A proteincsíkokat autoiadiográfiával tesszük láthatóvá. Az eredmények szerint körülbelül 24 000 daltonnál új protclncsík látszik, ami a nem-indukált, vagy a nem-transzformált sejtekből álló tenyészet mintáiban nem látható. A szarvasmarha növekedési előhormont ismert módszerekkel, például gél-szűréssel, ioncserés kromatográflával, affinitás-kromatográfiával, és különböző oldhatósági különbségeken alapuló módszerekkel tisztítjuk. A növekedési előhormont Jackson és munkatársai (lásd előbb) szerint alakítjuk át növekedési hormonná. C) A 7A-C. és 8A-B. példákban megadottak szerint előállított szarvasmarha növekedési hormont meghatározó dczoxi-ribomikleinsavhoz vég-ligációval 5 - CCGGATCCGGATG-3-szekvenciájú, specifikus molekulát kötünk az egyik szálhoz, és ennek komplementerét a másikhoz. Ezt a módosított dezoxi-ribonukleinsavat ezután a 10B. példában megadottak szerint módosított ptrpE30 plazmidba építjük be. A gazdabaktériumot transzformáljuk és tenyésztjük, a kapott szarvasmarha növekedési hormont a 10B példában megadottak szerint eljárva tisztítjuk. A találmány szerinti eljárást specifikus kiviteli példákkal írtuk le, érthető azonban, hogy ezek tovább módosíthatók. A találmány oltalmi köre bármely olyan módosításra vagy adaptációra kiterjed, amely általánosságban a találmány alapgondolatait követi, vonatkozik továbbá mindazon alapkísérletekre is, amelyek a tudományág napi gyakorlata alapján, de a jelen leírás szellemében készülnek. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
