195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
1 195 534 2 pepiidből áll. A fúziós fehérje termelése a trp promotoroperátor rendszer irányításával történik. 20 jtig fenti plazmidot a Pvull restrikciós enzimmel kezeltünk, amely öt helyen hasítja el a plazmidot. A (2) jelzésű génrészeket az EcoRI összekapcsolókkal egyesítettük (amelyek a pCATGAATTCATG szekvenciájú (3) jelzésű önkiegészítő oligonukleotidból állnak), és így egy EcoRI hasítási helyet vittünk be későbbi klónozáshoz egy EcoRI helyet tartalmazó plazmidba (a „p” jel a foszfátészter-csoport helyére utal). A pGMl plazmidból kapott 20 /Ug (2) jelzésű DNS- részeket 10 egység T4 DNS ligázzal kezeltük 200 pikomol 5'-foszforilezett szintetikus pCATGAATTCATG oligonukleotid - (3) jelzésű anyag - és 20 fű T4 DNS ligáz puffer (20 mmól írisz, pH = 7,6, 0,5 mmól ATP [adcnozin-trifoszfát], 10 mmól magnéziumklorid, 5 mmól ditiotreitol [treo-l,4-dimerkapto-bután-2,3-diol] jelenlétében 4 °C-on egy éjszakán át. Az oldatot ezután 10 percig tartottuk 70 °C-on az összekapcsolás megállítására. Az összekapcsolókat EcoRI elbontással lehasítottuk, és a most EcoRI végeket tartalmazó részeket szétválasztottuk 5 % poliakrilamidgéllel végzett elektroforézissel (PAGE). A három legnagyobb géntöredéket úgy különítettük el a géltől, hogy először megfestettük etidium-bromiddal, majd ultraibolya fénnyel lokalizáltuk a génrészeket és levágtuk a gélről a számunkra fontos részeket. Az egyes géldarabokat 300 pl 0.1XTBE puffer-oldattal együtt dializáló zsákba tettük, és elektroforézisnek vetettük alá 1 órán át 100 V feszültségen 0.1XTBE puffer-oldatban. (A TBE puffer összetétele: 10,8 g trisz bázis, 5,5 g bórsav és 0,09 g etilén-diamino-tetraecetsavdinátriumsó 1 liter vízben). Â dializáló zsákban összegyűlt vizes oldatot eltávolítottuk, fenollal extraháltuk, kloroformmal extraháltuk, a nátriumklorid-koncentrációját 0,2 mólra állítottuk be, és a DNS-t etanolos kicsapás után a vizes közegből kinyertük, [A DNS töredékek elkülönítését minden esetben a fentebb ismertetett módon, poliakrilamidgél-elektroforézissel (PAGE), majd elektroelúcióval végeztük], A trp promotor-operátort tartalmazó, EcoRI ,,tapadós” végekkel ellátott gént - (5) jelzésű az 1. ábrán - a későbbiekben leírt módon azonosítottuk. Ez a gén lehetővé teszi azt, hogy töredéket illesszünk egy tetraciklinre érzékeny plazmidhoz — (6) jelzésű az 1. ábrán —, amely azután rezisztens lesz tetraciklinnel szemben. B) A pBRHtrp plazmid kialakítása, amely tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosít a trp promotoroperátor hatására, és az A) pont szerint elkülönített, az 1. ábrán (5) jelzésű DNS töredéket tar. talmazó trp promotor-operátor azonosítása és szaporítása. A pBRHl plazmid - ATCC 37 070, (6) jelzésű, az 1. ábrán < — > — ampícillinnel szemben rezisztens, és a tetraciklinnel szembeni rezisztenciáért felelős gént tartalmazza, azonban - hozzákapcsolt promotor hiányában - nem jelenik meg ez a rezisztencia <[R. I. Rodriguez és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6, 3267— 3287 (1979)]>. Ennek megfelelően a plazmid érzékeny tetracsklinre. Ha az EcoRI helyen beviszünk egy promotor-operátor rendszert, a plazmid rezisztens lesz tetraciklinnel szemben. A pBRHl plazmidot elbontottuk EcoRI-vel és az enzimet eltávolítottuk fenolos extrakcióval, majd kloroformos extrakcióval. és vizes közegből nyertük ki etanolos kicsapás után. A kapott DNS molekulát, amely az 1. ábrán (7) jelzésű, külön reakcióelegyekben összekapcsoltuk a fenti A) pont szerint kapott három DNS töredék mindegyikével, és T4 DNS ligázzal kezeltük a fentebb leírt módon. A reakcióelegyben jelenlévő DNS-t felhasználtuk a megfelelő Escherichia coli K-12 törzs 294 jelzési! baktériumainak (ATCC 31448) transzformálására [K. Backman és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 73, 4174-4198 (1976)], a szokásos módszerekkel [V. Hershfíeld és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71, 3455-3459)], és a baktériumokat 20 jug/ml ampicillint és 5 jug/ml tetraciklint tartalmazó LB táptalajlemezekre vittük fel. Több, tetraciklinnel szemben rezisztens tenyészetet kiválasztottunk, a plazmid DNS-t elkülönítettük, és a kívánt töredék jelenlétét restrikciós enzimes analízissel igazoltuk. A kapott, pBRHtrp jelű plazmid - (8) jelzésű az 1. ábrán - bétalaktamázt fejez ki és rezisztenciát biztosít ampicillinnel szemben. Olyan DNS töredéket tartalmaz, amely magába foglalja a trp promotor-operátort és három fehérjét kódol. Az első feliérje a trp vezető első hat aminosavját és a trp E polipeptidnek közelítőleg utolsó harmadát (LE') tartalmazza összekapcsoltan. A második fehérje a trp D polipeptid mintegy első felének (D') felel meg, a harmadik polipeptid pedig a tetraciklinnel szemben rezisz!enciát biztosító gén által kódolt. C) Gének klónozása különféle polipeptid végtermékekre, és ezek előállítása a végterméket és specifikusan elhasítható trp D polipeptid prekurzort tartalmazó összekapcsolt fehérjék alakjában (2. ábra). A trp promotor-operátort és az LE' és D’ polipeptidekhez szükséges kódonokat tartalmazó DNS töredéket a pBRHtrp plazmidból nyertük, és olyan plazmidokba illesztettük be. amelyek különböző kívánt polipeptidekhez szükséges szerkezeti géneket tartalmaznak. Az alábbi példa a szomatosztatinra vonatkozik (2. ábra). A pBRHtrp plazmidot elbontottuk az EcoRI restrikciós enzimmel, és a kapott, az ábrán (5) jelzésű töredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel és elektroelúcióval különítettük el. Az EcoRI enzimmel elbontott pSom 11 plazmidot [K. Itakura és munkatársai. Science, 198, 1056 (1977); 2 007 676A sz. publikált nagy-britanniai szabadalmi bejelentés] összekapcsoltuk az (5) jelzésű töredékkel. Az elegyet T4 DNS ligázzal kezeltük a korábban leírtak szerint, és a kapott DNS-t Escherichia cob K-12 törzs 294 jelzésű baktériumaiba vittük át a korábban ismertetett módon. Az átalakított baktériumokat ampicillin-tartalmú táptalaj lemezeken választottuk ki. A kapott, ampicillinnel szemben rezisztens tenyészeteket tenyészet-hibridizációval [M. Gruensteln és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 72, 3951—3965 (1975)] vizsgáltuk, a pBRHtrp plazmidtól elkülönített, P37 radioaktív izotóppal jelzett, trp promotor-operátort tartalmazó (5) töredék alapján. Tenyészet-hibridizációval pozitívnak bizonyult tenyészeteket választottunk ki, a plazmid DNS-t elkülönítettük és meghatároztuk a beiktatott részek orientációját restrikciós analízissel, amelynek során a BglII és BamHI 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
