195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
1 195 534 2 szakasz kiiktatódott az (5) trp operonrészből (1. ábra), és így megszűnt a trp D polipeptid szerkezeti génje. A trp vezető szekvencia az 1—162 alappárokból (pbl-162) áll, a trp mRNS kiindulási pontjától kezdve. A tizennégy aminosavból álló trp vezető polipeptidet a bp27-71 kódolja az ATG nukleotidok után, amelyek a lefordítás startjelét kódolják. A trp csillapító tartomány egymást követően nagy GC- (guanin-citozin) és AT- (adenin-timin) tartalmú szekvenciákat tartalmaz, amelyek bpll4 és 156 között helyezkednek el, és a csillapítás nyilvánvalóan a trp vezető szekvencia bp~ 134-141 része által kódolt mRNS nukleotidokon történik. Ahhoz, hogy heterológ polipeptidet állítsunk elő a trp vezető riboszóma kapcsolódási hely irányításával, és egyidejűleg megakadályozzuk a csillapítást, az alábbi kritériumoknak kell teljesülniük: 1. Ki kell iktatnunk a 134-141 közötti vagy az ezen túli bázispárokat. 2. A beillesztett gén ATG kódonját megfelelően kell elhelyezni valamelyik riboszóma kapcsolódási helyéhez képest, amint az közismert {például J. A. Steitz: „Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", Biological Regulation and Control, (szerkesztő R. Goldberger), Plenum Press, New York, 1978]. 3. Ha összekapcsolt homológ-heterológ fehérje előállítása a cél, hozzáférhetőnek kell lennie egy homológ polipeptid szekvencia lefordítási startjelének, és az összekapcsolt fehérje homológ részét úgy kell beilleszteni a fázisba, hogy ne zavarja a lefordítás megállító jeleit. Ha például a trp vezető szekvencián belül bp70-től kezdve az összes bázispárt kiiktatjuk, akkor ezzel eltávolítjuk a csillapító tartományt, és visszamarad az ATG szekvencia, amely kódolja a lefordítás startjelét és kiküszöböli az A és az azt követő nukleotidok eltávolításával a tea (bp69-71) által kódolt lefordítás-megállítót. Ez a kiiktatás összekapcsolt fehérje képződését eredményezi. Ez a fúziós fehérje a vezető polipeptiddel kezdődik, bármilyen beillesztett heterológ gén által kódolt módon fejeződik is be, és tartalmaz egy olyan tartományt, amely a vezető utáni trp operon polipeptidek egyikéből áll. Ez utóbbit a 3' irányban végrehajtott kiiktatás mértéke határozza meg. Tehát egy olyan kiiktatás, amely az E génre is kiterjed, homológ prekurzor kifejezését eredményezi, amely az L szekvenciát és a távoli E tartományt tartalmazza (a törlés végpontján túl), hozzákapcsolva bármelyik későbbi beillesztés által kódolt szekvenciához, és így tovább. Két különösen értékes plazmid, amelyekből ki lett iktatva a csillapító tartomány, a pGMl és pGM3 plazmid [G. F. Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 133, 1457 (1978)]. Ezek a trp ALE 1413, illetve trp ALE 1417 kiiktatást hordozzák, és a trp promotor-operátor szabályozó hatására olyan polipeptidet fejeznek ki. amely a trp vezetőnek hozzávetőleg első hat aminosavját és az E polipeptid távoli részeit tartalmazza. A legelőnyösebb esetben — pGMl - minössze az E polipeptid utolsó harmada fejeződik ki, míg a pGM3 az E polipeptid kódonoknak közel a távolabbik felét fejezi ki. A pGMl plazmidot tartalmazó Escherichia coli K-12 törzset (W3110 tna 2-trp'"A102) helyeztünk letétbe az American Type Culture Collection intézménynél (ATCC 31622 számon). A pGMl ismert módon eltávolítható a törzsből az alábbiakban leírt műveletekhez történő felhasználáshoz. A találmány szerint bánnelyik kívánt helyen elhasíthatjuk a kétszálú DNS-t. E hasítási módszerre példát a későbbiekben ismertetünk (IV. rész). A kétszálú DNS-t egyszálú DNS-vá alakítjuk a kiszemelt hasítási pontot körülvevő tartományban, például lambda-exonukleázzal történő reagáltatással. A szintetikus vagy másmilyen egyszálú DNS-t Watson—Crick-féle bázispárosítással a korábban képződött egyágú rész hosszúságáig hibridizáljuk. Az alaprész (primer) szekvenciája biztosítja, hogy az 5' végződés ugyanott van, ahol a nukleotidé az első szálon, közvetlenül a tervezett hasítási pont előtt. Az alaprészt ezután meghosszabbítjuk a 3' irányban, DNS polimerázznl történő Tcagáltatással, és így ismét kialakítjuk az eredeti kétszálú DNS-nek azt a részét, a tervezett hasítási pont előtt, amely el lett távolítva az első lépésben. Ezzel egyidejűleg vagy ezt követően eltávolítjuk az első szálnak azt a részét, amely a tervezett hasítási ponton túl helyezkedik el. A felsorolt műveleteket az alábbiakban foglaljuk össze, „v"-vcl jelezve a tervezett hasítási pontot: a) ........... v tervezett hasítási pont „v” b) ........... y___egyszálúvá alakítva „v” .................... körül c) .......... v alaprész hibridizációja d) _____ y___ meghosszabbítás az alap.......... (_____ résztől e) .......... y az első szál egy részének ______ eltávolítása Előnyösen a fenti (d) és e) lépést egyidejűleg hajtjuk végre, olyan polimerázt használva, amely egyidejűleg elbontja a tervezett hasítási ponton túlnyúló egyszálú véget a 3' -»• 5' irányban és meghosszabbítja az alaprészt (dATP. dGTP. dTTP és dCTP jelenlétében) az 5’-* 3' irányban. Az erre a célra előnyös anyag a Klenow polimeráz I, azaz a DNS polimeráz I proteolitikus hasításával kapott termék, amely tartalmazza az eredeti enzim 5’-+3’ polimerizáló aktivitását és a 3'-*5' exonukleolitikus aktivitását, hiányzik azonban az eredeti enzim 5'->3’ exonukleolitikus aktivitása [A. Kornberg, DNA Synthesis, 98, W. H. Freeman and Co., SFO (1974)]. A fenti eljárás alkalmazásával kiiktathatjuk a csillapító részeket bármilyen kívánt módon a trp operont tartalmazó plazmidból: először lineárissá alakítjuk, például egy restrikciós helyen történő hasítással, túl azon a ponton, ahol a molekula „tompa végű” („v” jelzés a fenti ábrázolásnál). A csillapító rész kiiktatása után a szerkezetet önmagában ismert módon állíthatjuk helyre, például a „tompa vég” összekapcsolásával. Jóllehet heterológ polipeptideknek a trp promotoroperátor irányításával történő közvetlen expressziója is a találmány tárgyához tartozik, előnyösen fúziós fehérjéket állítunk elő, amelyek mind homológ, mind heterológ szekvenciákat tartalmaznak, s ez utóbbiak célszerűen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
