195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
1 195 533 2 Egyet kiválasztunk, és lambda NM 781 a Amy 1 jellel jelöljük. Ezt 1980. február 12-én NCIB 11572 sorszámmal letétbe helyeztük az NCIB törzsgyűjteményébe. C) A lambda NM 781 a Amy 1-ből származó amiláz gén újraklónozása a pBR 322 plazmidba 1 ßg lambda NM 781 a Amy 1 dezoxi-ribonukleinsavat és hasonló mennyiségű pBR 322 plazmid dezoxiribonukleinsavat hasítunk Eco Rí enzimmel, hasonló reakciókörülmények között. A ligációs reakciót és a transzformációt az 1. példában megadottak szerint végezzük. A rekombináns plazmidot tartalmazó E. coli HB 101 kolóniákat amiláz-aktivitásuk alapján határozzuk meg. Egy ilyen telepet kiválasztunk, és E. coli CL 7002 (pCP 2) jellel jelöljük. Ezt a törzset 1980. február 12-én NCIB 11573 sorszámon letétbehelyeztük az NCIB törzsgyűjteményébe. D) A géntermék amplifikálása A lambda NM 781 a Amy 1 amilázt meghatározó génjét és az amiláz-termelést az alábbiak szerint erősítjük. Az E. coli HB 101 gazdabaktériumot LB táptalajban tenyésztjük 2 mmól magnézium-klorid jelenlétében, 37 °C hőmérsékleten. A tenyésztést addig folytatjuk, míg a tenyészet optikai sűrűsége 0,3 (650 tun hullámhosszon mérve) lesz. Ezután hozzáadjuk a tenyészethez a lambda NM 781 a Amy 1-et, a fágok mennyiségét úgy számítjuk, hogy baktériumsejtként 1-2 részecske jusson. Ezután 37 °C hőmérsékleten, erőteljes keverés közben folytatjuk a tenyésztést, mindaddig, míg a tenyészet optikai sűrűsége csökkenni nem kezd. Amikor 0.5 alá esik, összegyűjtjük a sejteket és jégen tartjuk. Centrifugáljuk a szuszpenziót, és a felülúszó amilázaktivitását meghatározzuk. Az E. coli Cl 7002 (pCP 2) törzs erősítését és enzimtermelését mind a telített tenyésztés módszerével, mind a kloramfenikolos erősítéssel elvégezzük az 1. példában megadottak szerint eljárva. Az amiláz aktivitását DNS-módszerrel végezzük mind a fág-lizátumban, mind pedig a rekombináns plazmidot hordozó E. coli tenyészetben. Az I. táblázatban megadjuk az eredeti B. coaguíans törzzsel kapott amilázaktivitásokat, megadjuk az extracelluláris és a sejthez kötött aktivitást is. A rekombináns fággal (lambda NM 781 a Amy 1) kapott aktivitásokat és a rekombináns plazmidot hordozó E. coli CL 7002 (pCP 2) törzzsel kapott aktivitásokat ugyancsak megadjuk. Az enzimtermelésben háromszoros növekedés következett be a rekombináns fággal, és még ennél is nagyobb a plazmid esetén (körülbelül 300-szoros). A lambda NM 781 a Amy 1 fág esetén az összes enzim felszabadul a sejtek lízisekor, ily módon a táptalajban van jelen. A plazmidot hordozó törzs esetén az enzim 96 %-a sejthez kötött. E) Ujraklónozás az E. coli sejteket lizogenizáló lambda-fág származékba Lambda lizogén E. coli vektor-gazdasejt rendszer előállításának szemléltetésére az alábbi kísérletet mutatjuk be. , .... , A kísérlet során az alábbi lambda fágot használjuk: T4 lig. Cl 857 Warn Ram Sam (lambda NM 989). A fágot és előállítását a J. Mol. Biol. Vol. 132, 1979-ben Írják le: Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4. I. Characterization of the Recombinants, Wilson és Murray, 471—491. oldal; továbbá II. Amplification and Separation of the Gene Product, Murray, Bruce és Murray, 493—505. Ez a fág tartalmazza a T4 bakteriofág dezoxi-ribonukleinsav ligáz génjét, és lizogenizálja az E. coli-t. Ezenkívül tartalmaz egy termoszenzitív immungént és két amber mutációt az E és S génben, sorrendben. Az S génben bekövetkező mutáció úgy változtatja meg a baktériumot, hogy ezzel a fággal fertőzve nem következik be a lízis. A szubklónozás célja az, hogy a dezoxi-ribonukleinsav-llgáz gént az amilázt meghatározó génnel helyettesítsük. A fágból és a plazmidból (pCP 2) származó dezoxiribonukleinsavat az Eco Rí enzimmel hasítjuk, és a fragmenseket összekötjük. A ligációs reakcióból származó fág-dezoxi-ribonukleinsavat ezután in vitro fehérjeburokba zárjuk (enkapszidáció), és a kapott plakkokat E, coli Sup E Sup F törzsre való széleszíás után figyeljük meg. Az amilázt-aktivitást mutató plakkokból izoláljuk a fágot, a fágokat tisztítjuk, az előzőekben megadott módszerrel. Ezt a fágot használjuk a továbbiakban az E. coli C 600 (CL 1205) törzs lizogenizálására, ezt ismert módszerekkel végezzük. A lizogén kolóniákat keményítőt tartaLmazó lemezeken vizsgáljuk, jódfestést követően. Ezt a törzset E. coli Cl 7003 (lambda a Amy 1) jellel jelöljük, és az NCIB törzsgyűjíeményébe letétbe helyeztük 1980. március 6-án, ahol a törzs az NCIB Î 1586 sorszámot kapta. A gén termékének amplifikálását az alábbiak szerint végezzük. A lizogén törzset 32 °C hőmérsékleten növesztjük LB táptalajban mindaddig, míg 650 nm hullámhosszon mért optikai sűrűsége 0,8 lesz. Ezután centrifugáljuk, és a sejteket friss LB táptalajban szuszpendáljuk, a táptalajt 45 °C-ra előmelegítjük. Ezután 15 percen át 45 °C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészetet, a litikus ciklus indukálására (mivel az immungén terméke termoszenzitív). Ezután erőteljes rázás közben, 37 °C hőmérsékleten folytatjuk a tenyésztést, 3 órán át. Az amiláz-aktivitást mind a felülúszóban, mind a sejtekben megmérjük. A kapott értékeket az I. táblázatban adjuk meg. A fentiekben szemléltettük a plazmidból új lambda fágba való szub-szub-klónozás módszerét. Nyilvánvaló, hogy a lambda NM 781 a Amy 1-ből származó dezoxiribonukleinsav ugyanilyen könnyen szubklónozható a lambda T4 lig. Cl 857 Warn Earn Sam fágba. Eljárhatunk oly módon is. hogy a donor dezoxi-ribomilclcinsavat direkt az utóbbi fágba juttatjuk, ezenkívül a szemléltetett módszer bármilyen variációja is elképzelhető. F) A lambda NM 781 a Amy 1, E. coli CL 7002 (pCP 2) és az E. coli 7003 (lambda a Amy 1) által termelt amiláz kinyerése és jellemzése Az enzim kinyerése az 1. példában megadottak szerint eljárva ozmotikus sokkot használunk. Ezenfelül. 5 1C 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
