195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
J 195 533 2 hordoz, és egyetlen restrikciós helyet tartalmaz a Pstl. Eco Rí, Hind III, Bam Hl és Sal I enzimekre. A Pst I helyen való hasítás és beépítés megszünteti az ampicillinnel szembeni rezisztenciát, ugyanakkor a Bam Hl és a Sal I helyekre való beépítéskor a tetraciklinnel szembeni rezisztencia szűnik meg. A Hind III helyre való beépítéskor esetenként megszűnik a tetraciklinnel szembeni rezisztencia, amely azt bizonyítja, hogy a klónozott gén nem hordozza saját promoterét. A pACYC 184 plazmid érintetlen állapotban tetraciklinnel és kloramfenikollal szembeni rezisztenciát hordoz, egyetlen restrikciós szakaszt tartalmaz az Eco Rí, Hind III, Bam Hl és Sal I enzimekre. Az ECO RI helyére való beépítéskor vagy hasításkor megszűnik a kloramfenikollal szembeni rezisztencia, a másik három (Hind Hl. Bam Hl és Sal I) helyre való beépítéskor hasonló eredményt érünk el, mint a pBR 322 plazmid esetén; ugyanis ez a régió mindkét plazmidban közös. A Bacillus subtilis-be való szubklónozáskor vektorként pC 194 plazmidot használunk. Ez a plazmid egyetlen Hind III helyet tartalmaz, és kloramfenikollal szembeni rezisztenciát hordoz. Gazda mikroorganizmus Mivel a lambda-fág származékai csak E. coliban fejeződnek ki, gazdasejtként a találmány szerinti eljárással előállított rekombináns fág dezoxi-ribonukleinsavhoz, ezt kell használunk. Ha a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav plazmidként létezik, úgy bármely olyan mikroorganizmus használható, amely képes elfogadni és replikáim a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, például más mikroorganizmus vagy élesztő, például Saccharomyces cerivisiae. Gyakorlati okok miatt E. coli törzseket (például HB 101) használunk legtöbb kísérletünknél, mivel ezek jól ismert törzsek genetikai szempontból, és érzékenyek fágok és plazmidok fertőzésére, következményként pedig enzim túltermelésre hajlamos sejteket kapunk. Ahogy az a IIA példában ismertetésre kerül, a rekombináns plazmid szubklónozható egy másik plazmidba, például a pC 194-be, amely rcplikálódik a B. subtilis-ben. Az eljárás részletei Az eljárást kétfázisú klónozási kísérlettel ismertetjük; az első fázisban fágot használunk, a másodikban pedig plazmidot. A kiválasztott donor mikroorganizmus, a restrikciós és ligációs enzimek és a lambda-fág származék meglétét követően elkülönítjük, a dezoxi-ribonukleinsavakat, elvégezzük a restrikciós reakciót, keverjük a két molekulát, és az összekötött szakaszokat ligációs reakciónak vetjük alá, az összes módszert leírásra nem szoruló, ismert technikával végezzük. Ezután a dezoxi-ribonukleinsavat biológiailag aktívvá tesszük transzfekcióval vagy in vitro beiktatással E. coli sejtben. A lambda-dezoxi-ribonukleinsavval végzett kísérleteink során rendkívül jó eredményeket értünk el egyszerű bejuttatással (enkapszidáció) [lásd Hohn és Murray, Proc. Natl. Acad. Sei., USA. 74, 3259-3263 (1977)]. Az idegen dezoxi-ribonukleinsavat megkapott kiónokat megfelelő módszerekkel azonosítjuk. Ha például NM590 vagy NM607 lamba-vektort használunk, [előállítását lásd Murray N. és munkatársai, Molec. Gen. Genet. 150, 53 61 (1977)] úgy ezek a kiónok, ha idegen dezoxiribonukleinsavat tartalmaznak, úgy világosan elkülönülő plakkokat produkálnak, az idegen dezoxi-ribonukleinsavat nem tartalmazók pedig zavarost. Ha például NM761 vagy NM781 lambda vektort használunk, [előállítását lásd Murray és munkatársai, Molec. Gen. Genet. 150, 53—61 (1977)] úgy az azonosítást oly módon végezzük, hogy laktóz indikátor táptalajban, például McConkey, EMB vagy X gal táptalajon tenyésztett E. coli lac amber recipiens sejtekre szélesztünk. Sok (több ezer) idegen dezoxi-ribonukleinsavat befogadott kiónt szélesztünk keményítőt tartalmazó táptalajon, és amilázt meghatározó gén jelenlétére szkrénelüiik, az előzőekben említett jódos festéssel. Természetesen óvatosan kell eljárnunk abból a szempontból, hogy ne használjunk túl nagy jódkoncentrációt, ugyanis ekkor a fágok elpusztulnak.. Ez a jelenség áll fenn, ha a jódot oldatként adagoljuk. Előnyös festési technikánk, során a lemezeket jódgőzök hatásának tettük ki rövid időn át. Ily módon jó eredményeket értünk el. A következőkben ismertetjük a pullulanáz aktivitással rendelkező kiónok kimutatásának előnyös módszerét; a módszer nem igényli a jódfestést. A fágokat BBL Trypticase plusz pullulán táptalajon széiesztjük, körülbelül 0,25 % koncentrációban. A pozitív plakkok körül a pullulán hidrolizálódik maltotriczzá a pullulanáz aktivitása révén, a maltotriózt a baktériumok felhasználják. Ily módon a maltotriózt felhasználó baktériumok jobban növekszenek a többinél, ezért a pullulanáz enzimet termelő plakkok környékén zavaros gyűrű látszik a növekvő baktériumok miatt, és ez könnyen megfigyelhető. A módszert részletesen a IV. példában ismertetjük. Ezután egy vagy több pozitív kiónt kiválasztunk, és szaporítunk. Ez természetesen tartalmazza a végső genetikai módszerekkel kapott mikroorganizmust, és felhasználható az előzőekben megadottak szerint megfelelő tenyésztéssel nagymennyiségű amiláz termelésére. Eljárhatunk oly módon is, hogy a kiónt dezoxi-ribonukleinsav forrásként használjuk egy második klónozási kísérlet során plazmidba vagy másba, előnyösen fágba való beépítésre. Az alábbiakban ismertetjük egy plazmidba való szubklónozás módszerét. Ismert módszerekkel a kiónok dezoxi-ribonukleinsavát elkülönítjük és restrikciós enzimekkel hasítjuk, ily módon hasítjuk a plazmidot is, a fragmenseket keverjük, és a rekombinált szakaszokat ligációs reakcióval összekapcsoljuk. Ha a pBR 322 plazmidot használjuk, úgy az amilázt meghatározó gént tartalmazó, felvett dezoxi-ribonukleinsavat magába foglaló kiónok identifikációját oly módon végezzük, hogy a dezoxi-ribonukleinsavat E. coli gazdasejtekbe transzformálva biológiailag aktívvá tesszük; a tenyésztést ampicillint vagy tetraciklint tartalmazó táptalajban végezzük a használt restrikciós enzimtől függően. A táptalaj keményítőt vagy pullulánt is tartalmaz, és az amilázt meghatározó gént tartalmazó kiónok identifikációját az előzőekben megadott módszerek egyikével végezzük. A pozitív kiónokat ezután tenyésztjük, és a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat az előzőekben ismertetett kloramfenikolos módszerekkel sokszorosítjuk. A mellékelt ábrákon (la, ábra) megadjuk a vad típusú 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
