195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
■-1 \ 1 195 533 2 A találmány a génsebészet területére vonatkozik, tárgya amiláz enzimet meghatározó gént tartalmazó rekombináns DNS (dezoxi-ribonukleinsav) előállítása, és ennek felhasználása amilolitikus enzimek termelésére alkalmas mikroorganizmusok konstruálására. Bár a ..génsebészet” kifejezést nagyszámú módszerek leírásakor használjuk, egy szervezet genetikai információjának mesterséges módosításakor, a jelen leírás és a szabadalmi igénypontok során kizárólag olyan módszerek kapcsán használjuk, amelyek során in vitro rekombináns DNS molekulákat állítunk elő egy donor mikroorganizmusból, vagy egy megfelelő vektorból; az utóbbiakat egy adott genetikai információ alapján választjuk ki, és a kiválasztott DNS molekulát bejuttatjuk egy megfelelő mikroorganizmusba (gazda mikroorganizmus), amelynek során az adott (idegen) genetikai információ részévé válik a gazdasejt információjának. A „genetikailag átalakított mikroorganizmus” kifejezést mind a leírás, mind a szabadalmi igénypontok során abban az értelemben használjuk, hogy a fenti technikákkal előállított mikroorganizmust definiáljuk. Az „amiláz” és „amilolitikus” enzim kifejezések szinonimák, és olyan enzimekre utalnak, amelyek katalizálják a keményítő, például az a-amiláz, 0-amiláz, izoamiláz — mint például az a-l,6-glükozidáz, mint például a pullulanáz —, továbbá a glükoamiláz, stb. hidrolízisét. Az utóbbi években természetesen rendkívül sok leírás található a genetikai sebészet vagy technológia terén (hogy csak két kitűnő összefoglalást említsünk a sok közül: DNA Cloning and the Analysis of Plasmid Structure and Function, Timmis, Cohen és Cabello, Prog. Molec. Subcell Biol., 6, 1978., 1—58. oldal; továbbá Lambdoid Phages that Simplify the Recovery of in vitro Recombinants, Murray, Brammar és Murray, Molec. gen. Genet., 150, 1977, 53—56. oldal). Az irodalomban több közlemény szól értékes tulajdonságokkal rendelkező, genetikailag megváltoztatott mikroorganizmusokról. Az SHO 52—76480 (1977. június 27-én közölt japán szabadalmi leírásban Maruo, Yoneda és Tamura) nagymennyiségű amilázt termelő mikroorganizmus törzseket közöl; ezeket in vivo technikákkal állítják elő mutagenezissel, transzdukcióval és transzformációval, amelyek során Bacillus mikroorganizmusban több genetikai információt változtatnak az amiláz termelés érdekében. A fenti technikák nem tartoznak a génsebészet körébe, és csak egy vagy néhány, közel rokon (genetikai szempontból) mikroorganizmusra korlátozódnak. Ezek a törzsek ezenkívül genetikailag nem erősíthetők (például fággal vagy plazmiddal) nagymennyiségű enzim termelés elérésére. Egy nemrégen megjelent közleményben Yoneda, Graham és Young (Cloning of a Foreign Gene Coding for Alpha-amylase in Bacillus subtilis, Biochemical and Biophysical Research Communications, 91, 1556—1564., 1979.) leírják egy a-amilázt meghatározó gén klónozását Bacillus subtilis mikroorganizmusba oly módon, hogy egy Bacillus amyloliquefaciens H mikroorganizmusból származó dezoxi-ribonukleinsavat hasítanak, a hasított szakaszt összekötik a phi 3T temperált fág dezoxi-ribonuklcinsavával, majd ezt követően Bacillus subtilis amilázt nem termelő sejteket transzformáinak. A szerzők nem találnak bizonyítékot a gén amplifikálásra az amiláz enzim termelése során; márpedig a jelen leírás alapvető célja ez. A találmány tárgya eljárás megfelelő tenyésztési körülmények között a donor mikroorganizmusnál lényegesen nagyobb mennyiségű amilolitikus enzimet termelő mikroorganizmus előállítására génsebészeti úton. A talál- 5 mány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerint olyan mikroorganizmust állítunk elő, amely által szintetizált amiláz egy vagy több, Ipari enzimatlkus keményítő-hidrolízisre különösen előnyösen használható tulajdonsággal rendelkezik, például a keményítő enzi- 10 matikus elfolyósítása és/vagy szaccharifikálása során adheziv, megfelelő molekulaméretfl malto-dextrinek, keményítő szirupok előállítására, maltóz, dextróz, stb. előállítására; ilyen tulajdonság például a magas hőmérséklettel szembeni rezisztencia, rezisztencia a nehézfém^ ionokkal szemben, stb, A találmány szerinti eljárás értelmében úgy járunk el, hogy először dezoxi-ribonukleinsavat különítünk el egy olyan baktériumból (a donor mikroorganizmus), amely 2p legalább egy amilolitikus enzim termelésére képes, ezután megfelelő restrikciós enzimmel hasítjuk ezt a dezoxiribonukleinsav molekulát, ugyancsak hasítjuk a vektorként szereplő, és a lambda-fágból származó dezoxi-ribonukleinsavat, rekombináns dezoxi-ribonukleinsav előállí- 2g tására egyesítjük a fenti hasított molekulákat és összekötjük őket, amiután az amilázt meghatározó gént tartalmazó fragmenseket kapunk. A rekombináns dezoxiribonukleinsavat ezután biológiailag aktívvá tesszük oly módon, hogy megfelelő gazdasejtbe juttatjuk (például 3Q E. coliba) in vitro módszerrel, vagy transzfekcióval. A kapott telepeket ezután megvizsgáljuk az amilázt meghatározó gén jelenlétére, egy vagy több pozitív kiónt kiválasztunk, és szaporítunk; ily módon új, genetikai technikákkal (génsebészettel) megváltoztatott mikro- 35 organizmust kapunk, amely képes megfelelő tenyésztési körülmények között olyan nagymennyiségű amiláz termelésére. amelyet a donor mikroorganizmus nem volt képes bioszintetizáini. Eljárhatunk oly módon is, hogy egy új fág dezoxi-ribonukleinsavát különítjük el, a 40 molekulát hasítjuk és egy második vektorba klónozzuk, ez lehet egy plazmid vagy egy másik fág is. Az új kiónokat megvizsgáljuk, és az amilázt meghatározó gén jelenlétére szelektáljuk. Egymás után következő szub-szubklónozást is végezhetünk. 45 A találmány szerinti eljárás továbbá előnye az új, génsebészeti módszerekkel megváltoztatott és amiláz túltermelő mikroorganizmusok előállítása területén az, hogy elsősorban egyetlen amilolitikus enzimet meghatározó gént juttat a sejtbe, azáltal nagymértékben 50 csökkenti a tisztítási lépések számát, amelyek használata szükséges a genetikai módszerekkel (génsebészettel} nem megváltoztatott mikroorganizmusok esetén. Ha egyszer a megfelelő rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó génsebészeti úton megváltoztatott ö mikroorganizmus rendelkezésre áll, úgy azt oly módon tenyésztjük, hogy a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejeződése erősödjön, és ezáltal a donor mikroorganizmusnál nagyobb mennyiségű amilázt kapunk, gg Abban az esetben, ha a vektor egy lambda-fágból származik, úgy a gazda mikroorganizmus szükségszerűen E. coli, az enzimtermelés és az amplifikálás az alábbiak szerint történik Ha a fág a sejtek Sízisét okozza, úgy a gazda-mikroorganizmust, azaz az E. colit a sejtek sek- 65 fzorozására tenyésztjük, megfelelő sűrűségig; ezt köve2
