195522. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers inzulin kiszorításos kromatográfiás tisztítására
1 195 522 ■) kiszorításnak nevezzük.) Találmányunk további előnye az is, hogy gradiens kiszorítást alkalmazva a szennyezőket tartalmazó inzulin készítmények egyetlen művelettel preparatív méretben is tisztíthatók. Találmányunk szerint e kedvező változások elérését az teszi lehetővé, hogy a szomszédos komponens-zónák közötti átfedés mértéke elsősorban az oszloptöltct szemcseméretétől, az ágy szerkezetétől és az áramlási sebességtől függ, de nem függ a kiszorítószer aktuális koncentrációjától. Ha a találmányunk szerint végzett elválasztás célja a minta gyengébben kötődő komponenseinek tisztán történő kinyerése és az erősebben kötődő komponensek tisztán történő előállítására nincs szükség, akkor az elválasztást kis koncentrációjú kiszorítószerrel kezdjük, majd miután a tisztán kinyerni kívánt komponensek elhagyták az oszlopot, megnöveljük a kiszorítószer koncentrációját vagy betáplálási sebességét. Ennek hatására az oszlopon maradt anyag az eredetinél nagyobb koncentrációban, minimális oldattérfogattal eltávolítható az oszlopból. A találmányunk szerinti eljárásban pufferként előnyösen foszforsav/dihidrogén-foszfát pufferrendszert alkalmazunk. Különösen előnyös, ha a vivőfázis 2— 10 tf.%, például 5 tf.% metanolt tartalmaz, és a foszfátpuffer koncentrációja 10-100 inmól/liter, előnyösen 50 mmól/liter. A kiviteli példánkban kiindulási anyagként felhasznált „nyers inzulin” a kereskedelmi forgalomban beszerezhető tisztítatlan nyers marhainzulin volt. A nyers marhainzulin inzulin-tartalma 76,7 % volt. A találmányunk további részleteit a kiviteli példák szemléltetik a találmány korlátozásának szándéka nélkül. 1. példa 4,6 mm belső átmérőjű, 250 mm hosszú, 5 pm szemcseméretű (Nucleosil C8 jelű. alkilezett szilikagélből álló, Macherey-Nagel, NSZK gyártmányú) hidrofób állófázissal töltött oszlopot 5 tf.% metanolt tartalmazó pH 2,2-es, 50 mmól/1 koncentrációjú vizes foszfátpufferrel (vivőfázis) egyensúlyba hozunk. Az oszlopra 1400 jul-nyi fenti vivőfázisban oldva 140 mg szennyezett, nyers marhainzulint injektálunk 0,1 ml/min áramlási sebességgel. A minta felvitele után 0,1 ml/min sebességgel 10.mmól/l cetil-trimetil-ammónium-bromid koncentrációjú vivőfázis kiszorítószert viszünk az oszlopra. Az oszlopról eltávozó oldat fényelnyelését 295 nm-en mérve az 1. ábrán látható kiszorításos kromatogramot kapjuk. Az inzulin minta 76 és 114 ml között, 38 ml eluens térfogatban, 3,7 mg/ml átlagos koncentrációban hagyja el az oszlopot. A frakciók nagynyomású rétegkromatográfiás elemzéséből szerkesztett kiszorításos kromatogramból (2. ábra) kiszámolva a mintában lévő inzulin mennyisége és tisztasága a felhasználásra kiválasztott eluátum térfogatok függvényében az alábbiak szerint alakul: A kiválasztott frakcióban lévő inzulin mennyisége [mg] tisztasága [%] 77-től 82 ml-ig 16 >99 77-től 87 ml-ig 38 96,6 77-től 92 ml-ig 61 94,2 77-től 97 ml-ig 83 91,3 77-től 98 ml-ig 88 90,7 A táblázat adataiból látható, hogy a kiindulási anyagul felhasznált 140 mg nyers marhainzulinban lévő 107,4 mg (100% tisztaságú) inzulin 50,6%-a (88 mg) nyerhető ki a példa szerint 90,7 %-os tisztaságban. A végtermék tisztaságának rovására kinyerhető mennyiség növelhető. 2. példa Mindenben az. I. példában megadottak szerint járunk cl azzal az eltéréssel, hogy 150 mg nyers marhainzulinból indulunk ki, és 25 mmól/1 cetil-aminónium-bromid koncentrációjú vivőfázissal végezzük az eluálást. A 295 nm-en mért kiszorításos kromatogram a 3. ábrán látható. Az inzulin a 34 és 51 ml elucnstérfogat között, 8,8 mg/ml átlagos koncentrációban hagyja el az oszlopot. A frakciók elemzési adataiból szerkesztett kiszorításos kromatogram a 4. ábrán látható. Ebből kiszámítható, hogy a 34 és 36 ml közötti frakciók felhasználásával a bemért 150 mg nyers inzulinban lévő 115 mg tiszta inzulin 15,3 %-a nyerhető ki 99%-os tisztaságban. 3. példa Mindenben az 1. példában megadottak szerint járunk el azzal az eltéréssel, hogy az eluálást 92 ml 10 mmól/1 cetil-trimetil-ammónium-bromid tartalmú vivőfázis átbocsátása után 50 mmól/1 cetil-trimetil-ammóniumbromid koncentrációjú vivőfázissal folytatjuk. A 295 nm-en mért kiszorításos kromatogram az 5. ábrán látható. A frakciók elemzéséből szerkesztett kiszorításos kromatogramot a 6. ábra tünteti fel. Ebből látható, hogy a 95 ml-es frakció után erősen megnőtt az oszlopról lejövő oldatban az inzulin és a szennyező anyagok koncentrációja. Az ehiált anyagok jelenlétére utaló jel 102 ml eluátum térfogatnál esik vissza az alapvonalra. Ekkor már az oszlopról lejött az összes felvitt anyag. Ha ezután az oszlopot újra a cetil-trimetil-ammóniumbromidot nem tartalmazó vivőfázissal öblítjük át, az újra alkalmassá válik inzulin tisztítására. Az 1. és 2. példában megadott eredményekhez hasonlókat kapunk, ha az oszlop töltetet a fentiekben megadott Nucleosil C8 helyett oktadecilezett szilikagélből (LiChrosorb RP-18 jelű, Merck, NSZK gyártmányú termék) készítjük, illetve ha a vivőfázis pH-ját 1 és 3 között választjuk meg, vagy a tiszta inzulin fő tömegének eluálását 10-50 mmól/1 cetil-trimetil-ammóniumbromidot tartalmazó fenti vivőfázissal végezzük. A nyers inzulin felvitelénél és eluálásánál alkalmazott oldatok metanol tartalma 2 és 10 tf.% között volt változtatható. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a nyers inzulin kiszorításos kromatográfiás tisztítására, azzal jellemezve, hogy egy 2-10 tf.% metanolt, és egy 1-3 közötti pH-jú pufferrendszert tartalmazó vizes vivőfázissal egyensúlyba hozott hidrofób, alkilezett szilikagél állófázisra a nevezett vivőfázisban oldva felvisszíik a tisztítandó nyers inzulint, majd a tiszta inzulin fő tömegét 10-100 mmól/liter koncentrációban cetil-trimetil-ammónium-3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
