195514. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a primicin (triamicin ?) antibiotikum-komplex feltárására

1

J 95 514

2

1. példa

Triamicin-komplex feltárása VRK-s módszerrel Vizsgálandó termékek:

1. minta: szerkezeti felderítéshez használt „antibiotikum-szulfát ” (1974) metanolból kétszer ^kristályosítva. Op.: 192—195 °C (bomlás közben),

Biológiai aktivitás: Bacillus subtilisre: 0,03 £ig/ml.

2. minta: 83%-os dimetilformamidból kristályosított termék, 37 °C-on, 20 napig kristályosítva. Op.: 202- 206 °C (bomlás közben).

Biológiai aktivitása: 0,03 jug/ml.

3. minta: ipari előállított „antibiotikum-szulfát” (Chinoin 781 201) (1982). Op.: 178-180 °C, biológiai aktivitása: 0,05juml/ml.

4. minta: a 3. mintából anioncserélővei kapott bázis (1982), metanolból átkristályosítva. Op.: 182-184 °C, bomlás közben biológiai aktivitása: 0,03 pgjnú.

Alkalmazott készülékek:

1. Varioperpex Peristatilc. pump. LKB 12 000, Sweden.

2. Shimadzu High-speed TLC scaner (GS-920) Desaga, Heidelberg.

Alkalmazott vékonyréteg-lemezek:

1. DC-Plastikfolie Kieselgel 60 F254, 0,2 mm;

2. DC-Alufolie Kieselgel 60 (ohne Indikator),

0,2 mm;

3. PSC-Fertigplatten, Kieselgel 60 F254, 2 mm, mindhárom Merck gyártmány.

Alkalmazott oldószerrendszerek:

I., II., III., IV.: összetételüket a leírás 5. oldalán ismertettük.

Kromatográfiás művelet: az 1. és 3. mintát etanol :nbutanol :víz = 25 :25 :50 térfogatarányú elegyében melegen (50 °C), a jobban oldódó 2. és 4- mintát metanolban oldottuk, rázogatás közben. A minta kis részletét áramló hideg levegővel szárítottuk fel a startpontra, csíkban.

Az oldószer gőzével egy éjjelen át telített, szűrőpapírral bélelt kádakban nyújtva, azaz kétszer futtattunk. A lemezeket áramló hideg levegővel oldószermentesre szárítottuk.

Detektálás:

Kémiai detektálás: vanilin-kénsavas, illetve Sakagucchi reagenssel: a leírás 6. oldalán ismertettük az elkészítésük és felhasználásuk módját.

Bioautográfia:

Táptalaj: Beef extract Difco 3 g

Bacto pepton Difco 5 g

Nátriumklorid 5 g

Dinátriumhidrogénfoszfát 10 g

Káliumdihidrogénfoszfát 1 g

Bacto agar Difco 18 g

1000 ml desztillált vízben oldva.

Az elkészített táptalajt 121 °C-on sterilizáljuk, majd pH-ját 8,0-ra állítjuk be. 130 ml táptalajt öntünk 53 °C- on 18X25 cm-es steril üvegtálcákba. Elkeverjük Bacillus subtilis ATCC 6633 spóraszuszpenzioyai, 1 :2000 arányban. Az oldószermentesre szárított kroinatogramokból 5—5 mm es csíkokat vágunk és a megdermedt agariemezre helyezve 37 °C-on 18—24 órát inkubáljuk.

2. példa

Triamicin-minták minőségi és mennyiségi meghatározása VRK-s módszerrel

1. minőségi VRK:

Az I. példában leírt 1., 2., 3. és 4. mintából 0,5%-os oldatot készítünk, az I. példában leírt oldószerekkel. Az oldatokból 10—15 mikrolitert viszünk fel 10 mm-es startcsíkokban. A start-front távolság 10X10 cm-es lemezen 2X8 cm.

2. Kétdimenziós VRK:

Négyzet alakú lemezen a referencia-anyagokat a lemez szélén, frontvonallal elkülönítve, a vizsgálandó anyagot pedig a derékszög csúcsába vittük fel. A futtatásokat mindkét irányban kétszer nyújtva, azonos vagy különböző oldószerrendszerekkel végeztük. Az oldószerrendszereket a leírás 5. oldalán ismertettük.

3. Mennyiségi VRK:

A 0,5%-os töménységű oldatokból 6 mm-es csíkra 10 mikrolitert (50 pg), vagy 1,0%-os oldatokból 10 mm-es csíkra 10 mikrolitert (100 pg) vittünk fel. A start-front távolság 20X20 cm-es vékonyrétegen: 2X16 cm. Az első és a második futtatás után gondosan szárított lemezeket vanilin-kénsavas reagenssel előhívtuk, majd egy napi állás után denzitométerrel kiértékeltük, 590 mm-nél. A „Distance” értékekből az Rf-értékeket, az „Area” értékekből a kromalogram %-os összetételét számítottuk ki ( 1. ábra és 1. táblázat).

3. példa

A triamicin-komplex komponenseinek mikropreparativ elválasztása

Az 1. példában ismertetett 4. minta 1%-os oldatából 2 ml-t viszünk fel 2 mm vastag PSC-üveglemezre, illetve 0,2-0,3 ml-t a 0,2 mm-es fóliarétegre, állandó sebességre állított peristaltikus pumpával, 18 cm-es startcsíkokra. A vastag lemezeket legalább háromszor, a vékonyrétegeket kétszer futtattuk nyújtva. Indikáláskor az oldószermentesre szárított üveglemezek jobb és balszélén 3—3 cm-es csíkot előre hűtött Sakaguchi reagensbe (I. majd II.) merítettünk, a foltok szobahőmérsékleten élénk piros színnel előjöttek. A fóliarétegek két széléről és közepéről 1-1 cm-es csíkot kivágtunk, majd a kromatogramot vanilin-kénsavval, 105 °C-on előhívtuk. A kijelölt kromatogramok alapján lekapart zónafrakciókat nrikroperkolátorban 10%-os ecetsavas metanollal a vanilinkénsavas reakció kimaradásáig eluáltuk. Az eluátum vákuumban kapott száraz maradékát az I. oldószerrendszer felső fázisában oldva, 4Xl/5-öd térfogatnyi desztillált vízzel kirázva, az antibiotikum a felső fázisban, a „rétegballaszt” pedig az alsó fázisban oszlik meg. A felső fázis vákuum-bepárlásával a rétegre szárított antibiotikum 90%-a eluálható. A kezdetben vastag-, majd ezt követően vékonyrétegen többszörös futtatással elválasztott főkomponcnsekct preparáltuk. Biológiai aktivitásuk Bacillus subtilis sorozathígítással mérve a következő:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5