195250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás triciklusos makrolidok előállítására
195250 Egy gramm, a Toyosato-chonál (Tsukuba Gun, Ibaraki prefektdra, Japán) gyűjtött talajhoz steril kémcsőben hozzáadtunk annyi steril vizet, hogy az össztérfogat 5 ml legyen. A kémcső tartalmát 10 másodpercig kevertük vortexszel, majd 10 percre állni hagytuk. A íelüluszóból hígítási sort készítettünk az egyes lépések közt 100-szoros hígítással. 0,1 ml hígított felületszót tiamin-hidrokloriddal kiegészített Czapek agarra vittük Petri csészékben (szacharóz 30 g, nátrium-citrát 3 g, dikálium-hidrogén-foszfát 1 g, magnézium-szulfát 0,5 g, kálcium-klorid 0,5 g vas -(II)-szulfát 0,01 g, tiamin-hidroklorid 0,1 g, agar 20 g, csapvíz 1000 ml, pH-7,2). A 21 nap alatt 30°C hőmérsékleten kinőtt telepeket ferde agarra vittük [élesztő-, malátakivonatos agar (ISP-2 táptalaj), és 10 napon keresztül 30°C hőmérsékleten tenyésztettük. Az így nyert telepek közül izoláltuk a Streptomyces tsukubaensis 9993 törzset. A fermentációhoz 160 ml, alábbi összetételű táptalajt öntünk 500 ml-es Erlenmeyer lombikba: 1 % glicerin, 1 % oldható keményítő, 0,5 % glükóz, 0,5 % gyapotmagliszt, 0,5 % szárított élesztő, 0,5 % kukorica lekvár és 0,2 % kálcium-karbonát (pH = 6,5 értékre beállítva). A lombikokat 120°C hőmérsékleten sterilezzük 30 percen keresztül. Minden egyes lombikot beoltunk egy kacsnyi Streptomyces tsukubaensis 9993 tenyészettel a ferde agárról, és körkörös rázógépen rázatjuk 4 napon át 30°C hőmérsékleten. Húsz rázott lombikcs tenyészettel beoltunk egy 200 literes fermentorban levő 150 liter táptalajt, melynek az összetétele a következő: 4,5 % oldható keményítő, í % kukoricalekvár, 1 % szárított élesztő, 0,1 % kálcium-karbonát és 0,1 % Adekanol (habzásgátlö, gyártó: Asahi Denka Co.,). A táptalajt előzőleg 120°C hőmérsékleten sterilezzük 20 percen keresztül. A fermentációt 30°C hőmérsékleten végezzük, percenként 250-es fordulatszámmal kevertetve, 150 liter/perc levegőztetés mellet. Négynapos fermentáció után a tenyészlevet 5 kg diatómaföld segítségével megszűrjük. A kiszűrt micéliumot 50 liter metanollá extraháljuk, a kapott 50 liter extraktumot egye sítjük a fermentlé szűrletével, és 10 liter „Diaion HP-20“ (gyártó: Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) nem ionos adszorbens gyantából készült oszlopon engedjük át. Az oszlopot 30 liter vízzel és 30 liter vizes metanollal mossuk, majd az eluálást metanollal végezzük. Az eluált csökkentett nyomáson bepároljuk, 2 liter vizes maradékhoz jutva. A maradékot 2 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az éti 1- -acetátos extraktumot csökkentett nyomáson olajos maradékig pároljuk. Az olajos maradékot kétszeres tömeg mennyiségű savas szí 1 ikagéllel (speciális szilikagél-12, gyártó: Fuji Devison Co.) keverjük össze, és a keverékből etil-acetáttal pépet készítünk. Az oldószert lepároljuk, a nyert száraz port 800 ml, ugyan31 ilyen szilikagélből készült oszlopra visszük, melyet n-hexánban készítünk el. Az oszlopot 3 liter n-hexánnal, 3 liter n-hexán/eti!-acetát 9:1 eleggyel (téri.), 3 liter n-hexán/etil-acetát 4:1 (térf.) eleggyel, végül 3 liter etil-acetáttal eluáijuk. A kívánt vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük, és csökkentett nyomáson olajos maradékit pároljuk. A maradékot n-hexán/etil-acetát 1:1 (térf.) arányú elegyének 30 milliliterében oldjuk, és 500 ml szilikagélből (Merck Co., Ltd., szita lyukbőség: 0.070 — 0,037 mm) ugyanebben az oídószerelegyben készült oszlopot kromatografáljuk. Az eluálást 2 liter n-hexán/etil-acetát 1:1 (térf.) és 1,5 liter n-hexán/etil-acetát 1:2 (térf.) eleggyel végezzük. Az FR-900506 vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepárolva, sárgás olajat nyerünk. Az olajos maradékot tömegének kétszeres mennyiségű savas szilíkagéllel keverjük össze és etil-acetátot adunk hozzá. A nyert pépből az oldószert eltávolítva, a kapott száraz port n-hexánban készült szilikagéloszlopon kromatografáljuk, ugyancsak n-hexánnal eluálva. Az FR-900506 vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, 1054 mg nyers FR-900506 vegyületet nyerve fehér por alakjában. 100 mg nyers terméket HPLC-vel tisztítunk tovább. Lichroseorb Sí 60 (rnerck) oszlopot (8x x500 nm) használunk, a mozgó fázis metilén-klorid/dioxán 85:15 (térf.) arányú elegye; átfolyási sebesség 5 ml/perc; detektálás UV detektorral, 230 nm-en. Az UV pozitív frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A HPLC tisztítást megismételve 14 mg tisztított FR-900506 vegyületet kapunk fehér por alakjában. A nyersterméket adó szilikagéloszlopot tovább eluálva 1,5 liter etil-acetáttal és az FR-900525 vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítve, majd csökkentett nyomáson bepárolva, 30 mg nyers FR-900525 anyagot nyerünk sárgás olaj alakjában. ?.. példa 500 ml-es Erlenmeyer lombikba 100 ml alábbi összetételű táptalajt mérünk: 1% glicerin, 1% kukorica keményítő, 0,5 3 glükóz, 1% gyapottmagliszt, 0,5% kukoricalekvár, 0,5% szárított élesztő, és0,2% kálcium-karbonát, pH=6,5. A lombikot 120°C hőmérsékleten sterilizáljuk 30 percig. A táptalajt kacsnyi Streptomyces tsukubaensis 9993 tenyészettel beoltjuk, és 30°C hőmérsékleten tenyésztünk 4 napon át. A nyert tenyészetet 20 liter ugyanilyen táptalajra visszük át, amit egy 30 literes fermentorban sterileztünk előzőleg ki 120°C- on 30 percen át. A tenyészetet 2 napig inkubáljuk 30°C hőmérsékleten. 16 liter tenyészettel oltunk be 1600 liter következő összetételű táptalajt: 4,5% oldható keményítő, 1% kukoricalekvár, 1% szárított élesztő, 0,1% kálcium-karbonát és 0,1% Adekanol (habzásgátló; Asahi Denko Co.), pH=6,8. A fer-32 17 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
