195245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés sejthalmazból meghatározott biológiai sejtek kiválasztására, a kiválasztott sejtek legalább egy tulajdonságának megfigyelésére
Mint a fentiekből kitűnik, a sejtek egy adott részcsoportjának kiválasztása céljából, amikor is a fentiekben ismertetett vezérlő értékeket használjuk ki, a 12 csatornákat először pufferolt foszfátsó és f luoreszcein-diacetát (PBS -f- FDA) oldattal töltjük ki, aminek révén a kívánt sejtek kiválasztására minden egyes 1 sejthordozón mérési ciklust végezhetünk. Így kapjuk a kívánt részcsoportokat. Ezt követően a különböző stimuláló közegekkel, környezetükkel szembeni sejtviselkedés meghatározása céljából az egyes 12 csatornákat különböző stimuláló anyagokat tartalmazó oldattal töltjük ki, és így például meghatározható a fito-hemaglutinin (PHA), EF, CaBP, tumorkivonatok, vagy bármely más kívánt mitogén, illetve antigén értékelendő hatása. Ezt követően csak a kiválasztott részcsoportba tartozó sejtek válaszait figyeljük és szükség szerint rögzítjük. Az említett stimuláló közegeket vizsgálva megfigyelhető volt, hogy amikor a sejtet csak egyetlen közeg stimuláló hatása alatt vizsgáljuk, semmiféle befolyást nem gyakorlunk a következő stimnlálási folyamatra, ha az előző stimuláláshoz használt anyagot, illetve jelenség hatását a következő vizsgálat előtt átmosással, illetve más alkalmas módon sem legesítjiik. Ezzel az eljárással elkerülhető, hogv a stimuláló közegek között közvetlen kölcsönhatás vagy interferencia lépjen fel. Az előzőekben túlmenően az is kitűnt, hogy a sejteket az I sejthordozón rögzítve aktivációs szintjük nem változik. így az ingerlési folyamat az adott helyen levő sejtben az 1 sejthordozó felhasználása mellett mindenkor ismételhető, mégpedig különböző aktiváló közegek, anyagok alkalmazásával. így az egyes, a részcsoportba tartozó egyedi sejtek pontos válaszfolyamata a vizsgálathoz használt aktiválási folyamatokban jól meghatározható, idő szerinti változása követhető, és így az aktivált sejtek pontos száma és válasza értékelhető. Az 1 sejthordozón kialakított mátrixban az egyes sejtek helye az előzőekben leírt mérési ciklusok során és után változatlan marad. Az 1 sejthordozókkal kapcsolatban a fentiekben leírt tartószerkezetek többsége felülről történő letapogatásra van kialakítva, vagyis például az emittált fluoreszcens fényt az l sejthordozók 2 nyílásainak felső oldaláról lehet elemezni. Ennek előnye, hogy azonos optikai rendszer alkalmazható az optikai vizsgálatokhoz és elemzésekhez. A továbbiakban leírandó kiviteli alakokban az optikai elemző úgy helyezkedik el, hogy a 2 nyílások kisebb keresztmetszetű végén, vagy fenékrészén keletkező fényemisszió felfogására legyen alkalmas. így a sejt környezetében levő íluoreszcein fényemissziója által okozott zavaró hatások nemkívánatos optikai sugárzási hátteret jelentenek. Amikor a 2 nyílásokat hátulról vagy kisebb keresztmetszetű 17 10 felületekről tekintjük, ez a sugárzási háttér jelentősen lecsökkenthető, mivel a beszűkülő lyukpalást olyan ernyőként viselkedik, amely a nemkívánatos fényemissziót lezárja. Ezen túlmenően ingerlés esetén a nyílásokba behatoló fény, ha a nagyobb keresztmetszetű oldalról jut be, az összeszűkülő falakon tükröződik, és így mind a belső fény, mind pedig a fluoreszcens fény végeredményben visszaverődik. Az optikai elemzések javasolt elvégzési módjának másik előnyös hatása az, hogy az 1 sejthordozók adott pontjában csak a megfelelő nyílásban elhelyezkedő sejt fényemiszszióját mérjük, míg más olyan sejt, amely esetlegesen az 1 sejthordozó felső felületén jelen van, nem befolyásolja a mérési eredményt. További előnyt kell abban a tényben látni, hogy a 2 nyílások kisebb oldala felől sokkal könnyebb a gyakorlatban az egyes sejtektől származó fényemisszió külön-külön történő elemzése, nem áll fenn a szomszédos sejtek által emittált fénynyalábok kölcsönhatásának veszélye, amivel ellenkező esetben számolni kellene, hacsak a 2 nyílásokhoz viszonyítva nem a lehető legnagyobb pontossággal állítjuk be az optikai rendszert. A 7A., 7B., 8. és 9. ábrán olyan kiviteli alakok láthatók, melyek révén az optikai elemzés a fentieknek megfelelően végezhető. A 7A. és 7B. ábrán látható és mikroszkóppal ellátott optikai elemzővel együttműködő kiviteli alakban átfolyáskamra 110 oldalfala rugalmas (például gumiból készült) 111 üveghordozókat tartalmaz, amelyek mindegyike 112 üveglapot fog meg. A 112 üveglapok az I sejthordozó egy jól meghatározott pontjához (egy kiválasztott sejthez) viszonyítva vannak elrendezve. A rugalmas 111 üveghordozó a 112 üveglap és az átfolyáskamra 110 oldalfala között folyadékzáró kapcsolatot biztosít, és lehetővé teszi, hogy a mikroszkópot 113 objektív révén elegendően közel hozzuk az 1 sejthordozóhoz. így az egyedi sejtek vagy 2 nyílások alulról megfigyelhetők (7B. ábra). Fia a mikroszkóp 113 objektívje alsó helyzetben van (7A. ábra), az átfolyáskamra csatornája teljes szélességében szabad marad. Az itt bemutatott berendezés egy kiviteli alakjában (8. ábra) az átfolyáskamra alsó és oldalfalai mind rugalmas anyagból, előnyösen gumiból készülnek és egy egységet alkotnak. Ugyanennek a berendezésnek egy másik kiviteli alakjában (9. ábra) az optikai elemzést felső oldalról kiindulva vége'ízük. Itt az 1 sejthordozók 114 tartószerkezete 115 átfolyáskamra alsó részén van elrendezve, miután megfelelő berendezéssel a sejteket felvittük (ezt a berendezést a 12A. és 12B. ábrával kapcsolatban ismertetjük részletesen), és így az I sejthordozókban kialakított kúpos 2 nyílások lefelé növekvő átmérővel vannak elrendezve. Ahhoz, hogy a sejteket a kívánt helyen tartsuk, és az 1 sejthordozó 2 nyílásaiban hatékonyan megfogjuk, nyomás18 195245 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
