195005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés hemoglobin kvantitatív meghatározására biológiai mintákban
195005 4 (1) a vizsgálandó székletből, vizeletből vagy gyomornedvből a hemoglobint meghatározott tömegben vagy térfogatban tartalmazó vizsgálati mintát készítünk, (2) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét egy redukáló savval porfinné alakítjuk, majd megmérjük a minta fluoreszcenciáját, (3) egy korábban kimért fluoreszcencia-koncentráció diagram alapján a vizsgálati minta hemoglobin tartalmát meghatározzuk, minek során az (1) eljárás után adott esetben egy vizsgálati minta részletet a hemoglobin hem részét porfirinné alakítani nem képes redukálószerrel, előnyösen citromsavval kezeljük 100—150 °C közötti hőmérsékleten, és a minta fluoreszcenciáját megmérjük, és a (2) eljárásban úgy járunk el, hogy a) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét egy redukáló savval és egy redukáló sóval, előnyösen oxálsavval, ill. vas-oxaláttal vagy -szulfáttal 100—150°C hőmérsékleten kezelve alakítjuk porfirinné, kívánt esetben a vasionokat a mintából eltávolítjuk, majd megmérjük a minta adott esetben előkezelt felülúszó részének fluoreszcenciáját, vagy b) a vizsgálati mintában lévő hemoglobin hem részét egy redukáló savval és egy redukáló sóval, előnyösen oxálsavval, ill. vas-oxaláttal vagy -szulfáttal, valamint a reakcióelegyet szobahőmérsékleten gélszerű konzisztenciájúvá alakító hordozóanyaggal, előnyösen nagy molekulatömegű polimerek elegyével összekeverve, a kapott anyagot melegítés hatására elfolyósítva, majd az elegyet lehűtve porfirinné alakítjuk, éá megmérjük a minta fluoreszcenciáját, majd a (3) eljárásban kívánt esetben a 2. eljárás előtt és után mért fluoreszcenciaértékeket egymásból kivonjuk. Az eljárás során a nem fluoreszkáló hemoglobint kvantitatíve fluoreszkáló porfirinné alakítjuk. Ez az átalakulás végbemegy, ha a mintában levő hem vegyületet egy olyan reakcióelegyben hevítjük, amely megfelelő koncentrációban tartalmaz egy redukáló savat, mint például oxálsavat, és egy redukáló sót, mint például vas-oxalátot. Az eljárás során keletkezett porfirin koncentrációját fluoreszcenciás vizsgálattal határozzuk meg. A fluoreszcenciás mérést szilárd állapotban vagy pedig extrakció, vagy hígítás után folyékony rendszerben hajtjuk végre. A legtöbb biológiai minta, beleértve a széklet- és vizeletmintákat is, mutat egy bizonyos, általában alacsony fluoreszcenciát, amely nincs kapcsolatban a hem vegyület reakciójával. Ha az eljárást pontosítani kívánjuk, ennek a nem specifikus fluoreszcenciának — beleértve azt is, amely a normálisan kiválasztott porfirinokból származik — a szintjét meg kell mérni egy külön mintában, amelyben citromsavat vagy egy hason3 ló megfelelő, nem reagáló kompozíciót alkalmazunk az oxálsav — vas-oxalát rendszer helyett. A citromsav nem alakítja át a hemet porfirinné úgy, mint az oxálsav-vas-oxalát rendszer, de megteremti az azonos savas körülményeket a fluoreszcencia méréséhez, abban az esetben, amikor hem tartalmat nem mérünk. Ha a citromsavas mérés során kapott fluoreszcencia értéket kivonjuk az oxálsavas-vas-oxalát mintával mért értékből, akkor megkapjuk azt a fluoreszcencia értéket, amely a hemből képződött protoporfirinre jellemző. Ebből a fluoreszcencia különbségből egy korábban kimért fluoreszcencia-hemoglobin (vagy protoporfirin) koncentráció diagram alapján a hem vegyületek vagy a hemoglobin koncentrációja a székletben, vizeletben, vagy más biológiai anyagmintákban meghatározható. Egy gyors automata mérési módszer is kialakítható a fenti elv alapján a fluoreszcencia kvantitatív mérésre szilárd rendszerben. Ez az utóbbi egyszerűsített rendszer speciális vonásokat foglal magában, a veszteség (quenching) kiküszöbölésére, amely a fluoreszcenciában a közel ultraibolya fény excesszív abszorpciója miatt fellép (azon a hullámhosszon, amelyen a porfirin legintenzívebben fluoreszkál), amely a hemoglobin és más pigmentek nagy koncentrációjából adódik. Az automatizált eljárás abban az esetben is alkalmazható, ha a reakcióelegy szobahőmérsékleten gél vagy pasztaszerű, de hevítésre folyékonnyá válik. A találmány tárgyát képezi egy javított berendezés is, egy, a biológiai anyagból vett ismert mennyiségű minta összegyűjtésére és előkészítésére. Az ilyen berendezés különösképpen jól használható székletmínta összegyűjtésére, előkészítésére és a hemoglobin meghatározására ilyen mintákban. Ez a 18 berendezés egy 10 mintavételi eszközből és számos 19a, 19b, 20a, 20b kamrából áll, amelyek mindegyike megfelelő mennyiségű reakcióelegyet vagy nem reaktív kompozíciót tartalmaz. A 10 mintavételi eszköz olyan anyagokból készül, amelyek szobahőmérsékleten szilárdak, de megolvadnak és összekeverednek a vizsgálandó anyaggal a különböző 19a, 19b, 20a, 20b kamrákban olyan hőmérsékleteken, amelyeken az átalakítási reakciót végrehajtjuk. Előnyösen a 10 mintavételi eszköz összetétele hasonló azokhoz az anyagokhoz, amelyek közegként szolgálnak az oxálsavas-vas-oxalátos és a citromsavas mintákhoz. A találmány tárgyát közelebbről az alábbiakban ismertetjük az ábrákra való hivatkozással. Az 1. ábra egy székletminta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz keresztmetszetét mutatja. A 2. ábra egy székletminta vételére alkalmas 10 mintavételi eszköz keresztmetszetét mutatja, amelyben a 14 hüvely felső állásban van 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
