195004. lajstromszámú szabadalom • A metasztatikus sejtakativitás meghatározására szolgáló eljárás
alapján a hibridizációt végrehajtottuk. Két egérből származó immunizált lépsejteket NS—1 sejtekkel (murin mieloma sejtvonal, amelyet lép limfociták nem pusztuló partnere standard forrásaként használnak) vagy megfelelő mieloma sejtekkel fuzionáltunk, és a fuzionált sejteket 96 bemélyedést tartalmazó mikrotiter lapokra helyeztük úgy, hogy kb. 2X105 sejt került egy mélyedésbe, és egér peritoneum sejteket (makrofágokat) használtunk táplálék sejtekként (6X10*). A sejteket szelektív HAT-közegben (DMEM, mely 10~4 M hipoxantint, 10-7 M 1-amino-pentánt, 1,6X10~5 M timidint, 20 %-os FCS-t tartalmaz) tenyésztettük 3—4 héten keresztül. Ez a közeg csak a hibrid sejteket engedi növekedni. A sejteket ELISA módszerrel vizsgáltuk az antitest-képzés szempontjából és általában a mélyedések 10%-a volt pozitív. Az antitestek specifitását a Western elkenési technikával és immunológiai festéssel is vizsgáltuk. Az ELISA-eljárást 96 mélyedést tartalmazó mikrotiter-lapon hajtottuk végre. Minden mélyedésbe kb. 50—100 ng antigént helyeztünk és megszárítottuk. A szabad kötőhelyeket 50 pl 1 %-os FCS-sel 30 percig való inkubálással blokkoltuk, és a mélyedéseket PBS-sel mostuk. Antiszérumként 50 pl hibrid szupernatánst adtunk a mélyedésekbe' é§ inkubáltuk. PBS-sel való mosás után 50 pl 1 % FCS-t tartalmazó biotinilált ló anti-egér IgG oldatot (forgalmazza: JCN Immunobiologicals, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) adtunk hozzá, és 30 percig inkubáltuk, majd PBS-sel mostuk. Ezután avidin-biotin-peroxidáz reagenst (forgalmazza: JCN Immunobiologicals, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) adtunk hozzá és inkubáltuk. Ezután a peroxidáz-szubsztrátot (0,1 % o-dianizidint, 0,01 % hidrogén-peroxidot tartalmazó PBS) adtunk hozzá, és a képződött barna színt Titertek Multiscan spektrofotométerrel vizsgáltuk. A Western elkenési technika jobban használható az antitestek jellemzésére, mivel pontosan kimutatja, mely polipeptid-lánccal reagál az antitest. Az antigént vagy az antigént tartalmazó protein keveréket először 10 %-os nátrium-dodecil-szulfát poliakril-amid-gélen való elektroforézissel választottuk el, majd a proteineké) horizontálisan egy nitrocellulóz lapon futtattuk 0,1 A áramot használva egy éjszakán keresztül. Ezután a lapot heparin-toluidin festékoldattal (Gibco Labs. gyártmány) festettük meg. A proteint tartalmazó nitrocellulóz csíkokat ezután kivágtuk, és a színt 50 % etanolt, 8 % ecetsavat és 42 % vizet tartalmazó eleggyel eltávolítottuk. A csikók immunfestési vizsgálatát azután az ELISA módszerben alkalmazotthoz hasonló módon végeztük el. A pozitív antitestek csak az antigén barna színét eredményezték, de meg kell jegyeznünk, hogy amennyiben az antitest egy antigén tercier 7 szerkezet ellen irányul, negatív eredményeket kaphatunk, mivel a proteinek a gél elektroforézis alatt denaturálódnak. 4. PÉLDA A IV. típusú kollagenáz immunofestése Tisztított IV. típusú egér kollagenáz elleni nyúl antiszérumot alkalmaztunk ahhoz, hogy az enzim lokalizációját tanulmányozzuk normális és rosszindulatú emberi mellrákos szövetekben. 10 normális mellszövet mintából és 25 mellrákos szövetmintából vett 5 pm vastag krioszekciókat előinkubáltunk 1 %-os FCS-sel, majd PBS-sel mostuk. Ezután az antiszérum l:50-re hígított oldatát inkubáltuk a. mintákkal 2 órán keresztül 20 ‘Klón, majd PBS-sel mostuk. Ezután a metszeteket FITC-cel (fluoreszcein-izotíocianát, Sigma-gyártmány) konjugált kecske antinyúl szérummal inkubáltuk egy éjszakán keresztül 4°C-on, és PBS-sel mostuk, majd megvizsgáltuk a fluoreszcenciát. Az eredmények azt mutatták, hogy a normális szövetek egyike sem festődött meg, míg a 25 rákos szövet mindegyike tiszta fluoreszcenciát mutatott. A festődés az elterjedési készséggel rendelkező tumorok szélső részén volt a legintenzívebb, és a tumor sejtek 10—80 %-a pozitív volt. Humán HT—1080 szarkóma IV. típusú kollagenáz elleni monoklonális antitesteket használtunk tenyésztett HT—1080 sejtek, emberi mellkarcinoma sejtek (MCF—7) és emberi bőr fibroblasztok megfestésére. A sejteket fedőszalagon tenyésztettük szubkonfluencia eléréséig, és metanollal rögzítettük őket (—20°C hőmérséklet, 10 perc). A sejteket ezután előinkubáltuk 1 %-os FCS-sel, és PBS-sel mostuk, ezután az egér-IgG-antites(ekkel 2 órán keresztül 20°C-on inkubáltuk, és mostuk. Ezután a sejteket 30 percig biotinilezett ló antiegér IgG-vel (forgalmazza: JCN Immunobiologicals, Amerikai Egyesült Államok) inkubáltuk, mostuk és avidin-biotin-peroxidáz reagenssel (forgalmazza: JCN Immunobiologicals, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) inkubáltuk. Végül a sejteket peroxidáz szubsztráttal inkubáltuk. Az antitestek jól láthatóan festették a rosszindulatú HT—1080 és MFC—7 sejteket, míg a fibroblasztok negatív eredményt mutattak. Az immunofestésre vonatkozó mindkét példa jelzi, hogy a IV. típusú kollagenáz antitestjei képesek a rosszindulatú, elterjedési készséggel rendelkező rákos sejtek kimutatására. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás monoklonális antitestek előállítására, amelyek specifikusan kötődnek IV. típusú kollagenáz enzim antigénhez, azzal jellemezve, hogy IV. típusú kollagenáz enzim antigénnel immunizált egerek lépéből készült sejtszuszpenziót egér mieloma sejtekkel fu8 5 195004 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
