194942. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin származékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
194942 Amint az a 3. táblázatból látható, az MG 344-hF 49 és a Streptomyces cyaneus ISP 5108 törzs lényegében azonos tulajdonságokkal bír, kivéve a nitrát redukálását. A nitrát redukálása azonban nem tekinthető egy adott mikroorganizmus Actinomycetaként való azonosítása megbízható paraméterének és nem alkalmas két törzs egymástól való megkülönböztetésére sem. így az MG 344-hF 49 törzset a Streptomyces cyaneus fajjal igen szoros rokonságban levőnek tekinthetjük, és az MG 344-hF 49 törzset Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 törzsként azonosítottuk. Az (A) általános képletü antraciklinszármazékokat a találmány szerint az ezek termelésére képes, Streptomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmusoknak megfelelő táptalajon történő tenyésztésével, majd a vegyületeknek a tenyészetből való kinyerésével állíthatjuk elő. A táptalaj bármely olyan tápanyagforrást tartalmazhat, amelyet az antraciklinszármazékok termelésére képes mikroorganizmus hasznosítani tud. Ilyen tápanyagforrások a szénforrások, például a glicerin, glükóz, szacharóz, maltóz, dextrin, keményítő, valamint zsírok és olajok; a nitrogénforrások, így szerves anyagok, például a szójaliszt, a gyapotmagolaj kinyeréséből visszamaradó pogácsa, a húskivonat, pepton, szárított élesztő, élesztőkivonat és kukoricalekvár; valamint szervetlen anyagok, például ammóniumsók és nitrátsók, így az ammónium-szulfát, nátrium-nitrát és ammónium-klorid. Kívánt esetben olyan szervetlen sók is adagolhatok, mint a nátrium-klorid, kálíum-klorid, foszfátsók és nehézfémsók. A fermentálás alatt fellépő habzás megakadályozására adott esetben szokásos eljárással megfelelő habzásgátló anyag, például szilikonolaj is felhasználható. Az antibiotikum-gyártásnál szokásos gyakorlatnak megfelelően az antraciklinszármazékokat termelő mikroorganizmusok tenyésztésére is a legalkalmasabb módszer a folyékony, levegőztetett, süllyesztett tenyészet alkalmazása. A tenyésztést célszerűen 20—35°C, előnyösen 25—30°C hőmérsékleten végezzük. Attól függően, hogy rázott tenyészetet vagy levegőztető berendezéssel levegőztetett tenyészetet alkalmazunk, az antraciklinszármazékok termelése a találmány szerinti eljárással 3—7 náp alatt éri el a maximumot. Ily módon az antraciklinszármazékokat tartalmazó tenyészetet nyerünk. Az antraciklinszármazékok egy része magában a tenyésztett sejtben lehet, de nagyobb része a tenyészet szűrletében található. A találmány szerint előállított tenyészetből az antraciklinszármazékok bármely, a találmány céljára alkalmas ismert módon kinyerhetők. 11 Az alkalmas eljárások egyike extrakciós elven alapszik; a tenyészet szűrletében lévő antraciklinszármazékokat vízzel nem elegyedő, ditriszarubicint oldó oldószerrel extraháljuk (lásd az előzőekben ismertetett szakirodalmi helyen), így használhatunk például etil-acetát, butil-acetátot, kloroformot vagy butanolt. Nagy hatékonysággal végezhető az extrahálás, ha a tenyészet szürlete semleges vagy enyhén lúgos. Ha az antraciklinszármazékok a tenyésztett sejten belül találhatók, a sejteket szűréssel, centrifugálással vagy bármely más alkalmas módon kigyűjtjük a fermentléből, és a kívánt vegyületet a sejtekből, például etil-acetátos, kloroformos, metanolos, etanolos, butanolos, acetonos, metil-etil-ketonos, vizes hidrogén-kloridos vagy vizes ecetsavas kezeléssel nyerjük ki. Extrahálhatjuk a tenyészetet a fenti oldószerekkel közvetlenüt, a sejtek elkülönítése nélkül is. Extrahálhatjuk a sejteket homogenizálás után is. Másik lehetséges extrahálási eljárás az ellenáramú megoszlásos módszer. Más eljárás szerint az antraciklinszármazékokat adszorpciós elven alapuló eljárással nyerjük ki a tenyészetből. Az antraciklinszármazékot tartalmazó folyékony közegből, például a tenyészet szürletéből vagy valamely, az előzőekben ismertetett extrakciós eljárással nyert extraktumából oszlopkromatográfiás vagy folyadék-kromatográfiás eljárással vagy más adszorpciós eljárással, megfelelő adszorbens, például aktív szén, alumínium-oxid, szilikagél vagy „Cephadex LH 20" (Pharmacia Co.) alkalmazásával kinyerjük, majd az adszorbensről eluáljuk az (A) általános képletü• antraciklinszármazékot. Az így kapott oldatot vákuumban szárazra pároljuk, ily módon nyers antraciklinszármazékot nyerünk vörös por formájában. A nyersterméket az extrakciós és adszorpciós lépések kívánt számú ismétlésével, kívánt esetben ezek kombinálásával tisztítjuk. Ha szükséges, az anyagot átkristályosíthatjuk. Például szilikagél, Cephadex LH 20* gyengén savas ioncserélő gyanta vagy Diaion HP 20 (a Mitsubishi Chemicals Industries Limited terméke) töltet alkalmazásával végzett oszlopkromatográfiás eljárást vagy gélszűrést használhatunk folyadék-kromatográfiás (ellenáramú megoszlásos), nagynyomású folyadék-kromatográfiás vagy vékonyrétegkromatográfiás eljárással kombinálva, a megfelelő oldószer alkalmazásával. Közelebbről, például a nyers antraciklinszármazék port kis mennyiségű kloroformban feloldjuk és az oldatot szilikagél oszlopon engedjük át. A megfelelő eluálószer alkalmazásával a kívánt anyagot tartalmazó eluátumot nyerünk. A kívánt anyagot tartalmazó aktív frakciókat vákuumban bepároljuk. Ezután vékonyrétegkromatográfiás tisztítást végezve valamennyi végtermék lényegében tiszta formában nyerhető. További tisztításra nagy12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
