194939. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú gamma- és alfa-ciklodextrin előállítására
194939 nak kinyerésére (Horikoshi et al., Proceedings of ls/ International Conference of Cyclodextrins, Budapest, 1981. Reidel Publ. Co., 1982.). Az alkaloid species N° = 38—2 eredetű CGT-zal végzett béta-CD gyártás kristályosítási anyalúgját a lineáris-dextrin tartalom megbontása céljából amiloglükozidázzal kezelik, a reakcióelegyben keletkezett glükózt Diaion FRK—01 típusú ioncserélővel kiszűrik, majd a gamma-CD tartalmat Toyo Poarl HW—40 típusú gélszűrő oszlopon elválasztják, az effluens bepárlása és tisztítása után a gamma-CD-t kikristályosítják. Az eljárás hátránya, hogy mivel nem gamma-CD előállítására irányuló célzott módszer, a gamma-CD kitermelése meglehetősen rossz: 20 kg/tonna kiindulási burgonyakeményítő. Ismeretes, hogy 1—8 szénatomszámú alifás alkoholok és 2—4 szénatomszámú ketonok alkalmasak a CGT-katalizált keményítőciklizáló reakciók sebességének növelésére, ezáltal az alfa- és béta-CD termelés %-ának emelésére (80—156—595 sz. Japán Kokai, C.A. 94, 172.894), az alfa-CD %-ának emelésére pedig alkalmas binér komplexképző a nátrium-lauril-szulfát (77—79,0,39 sz. Japán Kokai, C. A. 87, 150.201). Célul tűztük ki olyan módszer kidolgozását, mellyel ugyanazon kiindulási anyagból, kívánság szerint zömmel alfa-CD, béta-CD, illetve gamma-CD állítható elő. Meglepő módon azt találtuk, hogy a kitűzött célnak megfelelő eljáráshoz jutunk, ha az általunk felderített konszekutív CD -képződésre alapozzuk előállítási eljárásunkat. E szerint a reakciómechanizmus szerint a már megtermelt alfa-CD-ből keletkezik a béta- és a gamma-CD-, méghozzá a gamma-CD a reakció utolsó fázisában keletkezik, amikor az enzim már jórészt inaktiválódott. Belátható tehát, hogy a konszekutív reakciósorban elsőként keletkező alfa-CD mennyisége limitálólag hat a béta- és gamma-CD mennyiségére, vagyis ha az alfa-CD kezdeti képződési sebességét megemeljük, ez a későbbi béta és gamma-CD termelésre kedvező hatással van. További limitáló faktor a késői reakciófázisban felhalmozódó jelentékeny mennyiségű lineáris dextrin, amelyek jelenlétében az eredetileg ciklikus termékek képződése felé irányuló enzimhatás a deciklizálás és a diszproporcionálás irányába tolódik el. Mivel, mint ismeretes, az egyes CD-k üregátmérője között nagy különbség van, a gamma-CD üregében nem elég nagy stabilitási állandóval komplexálódnak az alfa-CD és béta-CD lecsapószerek és a lecsapószer feleslegben a gamma-CD vagy egyáltalában nem keletkezik, vagy csak elhanyagolhatóan kis mértékben oldhatatlan zárványkomplex formájában. Az oldatban pedig a diszproporcionáló enzimhatás következtében lineáris dextrinekké reagál. Kísérleteink során azt találtuk, hogy ha a primer reakció, vagyis az alfa-CD keletkezé3 sének a sebességét valamely alkalmas anyaggal fokozzuk (pl. alifás keton, vagy alkohol), ezáltal az alfa-CD kezdeti koncentrációját megemeljük. Ugyanakkor ha ez az anyag a szekunder reakcióban keletkezett béta és gamma-CD-vel, és az alkalmazott második lecsapószerrel olyan terner komplexet képez, mely nagyobb stabilitású és rosszabb vízoldékonyságú, mint a primer reakcióban keletkezett biner komplex, akkor ezáltal a szekunder reakciótermékek aránya jelentősen megnő a konverziós termékben. Tehát ha az alfa- és a béta, ill. a gamma-CD lecsapószerek keverékét tesszük a konverziós elegyhez, akkor a reakcióközegben megnő a gamma-CD mennyisége. Ez az alapvetően új felismerés alkotja találmányunk lényegét. Célszerű a reakciókörülményeket úgy megválasztani, hogy a gamma-CD képződése minél gyorsabban menjen végbe, vagyis optimálni kell a CGT működését és a lehetőségekhez képest minél inkább háttérbe szorítani a diszproporcionáló hatást. Kutatásunk eredményei szerint tehát alkalmasan megválasztott terner komplex lecsapószer-keverék jelenlétében bármelyik CD-féleség előállítható a keményítő konverzió fő komponenseként. Az előállításhoz bármely amilóz-amilopektin arányú keményítő (pl. burgonya keményítő, kukorica keményítő, waxy-kukoricakeményítő, rizs-, tápióka-keményítő, különböző béta-amiláz-mentes gabonakeményítők, stb.), valamint amilóz, amilopektin és glikogén is felhaszálható az enzim szubsztátjaként. A szubsztátok közvetlenül vagy a nagyobb fajlagos hozam elérése céljából limitált savas, lúgos vagy enzimes előhidrolízisnek alávetve alkalmazhatók. A hidrolízist úgy állítjuk be, hogy a kapott parcinális hidrolizátum redukálóképessége 0,5 és 10 DE tartományban legyen. (DE érték jelentése: IDE = 1 tömeg% glükóz ekvivalens redukáló képessége, meghatározását a DIN 1263 szabvány szerint végezzük.) A limitált enzimes hidrolízishez alkalmazott alfa-amiláz bármilyen eredetű lehet, például Bacillus subtil is, Bacillus polymixa, Bacillus licheniíormis, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, stb. A fenti limitált hidrolízis esetén már a kezdeti reakciófázisban biztosítjuk, hogy glükozil-akceptor hiányában diszproporcionálódás ne mehessen végbe. Találmányunk szerinti eljárás kiindulási anyaga kukoricakeményítő, melyet részleges hidrolízisnek vetünk alá. A parciális degradációt Bacillus eredetű alfa-amilázzal végezzük, kalcium ionok jelenlétében, pH — 7 közegben, 80°C-on. Mielőtt a hidrolizátum redukáló képessége a 8 DE egységet meghaladná, 120°C-on, 105 pascal túlnyomáson végzett hőinaktiválással megszakítjuk az enzimes hidrolízist. így mintegy 10—40 tömeg%-os keményítő hidrolizátumot kapunk, melynek redukálóképessége kisebb, mint 8 DE egység. A hidrolizátum aránylag nagy lánchosszú4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
