194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
194938 Az eredeti mintákat szendvics-hibridizálással is megvizsgáljuk, nukleinsav-fragmensek sorozatát alkalmazva. A mintákat 2-butanolt használva koncentráljuk, hogy eltávolítsuk a folyadékot belőlük olyan módon, hogy a végső térfogat mintegy 800 pl legyen, a vizsgálathoz a minták koncentrációja mintegy 5—7-szeres lesz. Ez után 70 mmól/liter EDTA-t, 0,7% SDS-t és 200 pg/ml K proteináz enzimet adunk a mintához, és 15 percen át kezeljük 55°C hőmérsékleten, és 45 percen át 37°C hőmérsékleten. A mintát ez után 5 percen át forraljuk 0,175 mól/literes NaOH oldatban. A felforralt mintákat 0°C hőmérsékletre viszsziik át és semlegesítjük ekvimoláris menynyiségű ecetsavval, majd megvizsgáljuk. Az lb. példában leírt szűrőket és hibridizá 1 ási körülményeket alkalmazzuk a vizsgálatban. Az alkalmazott vizsgáló minta mKTH1245 (b,-b2), 300,000 cpm/400 pl hibridizáló reakciókeverék. Az eredmények a 3. táblázatban láthatók. 15 3. Táblázat Minta Hibridizált radioaktivitás A Chlamydia tenyésztés eredménye 1. férfi 151 + 2. férfi 164 + 3. férfi 154 + 4. férfi 61-5. férfi 76-6. férfi 55-1 . nő 343 + 2. nő 509 + 3. nő 362 + 4. nő 57-5. nő 58-6. nő 81-Puffer, Xi* 30-55 Chi. trachomatis L2 baktérium, 106 419 + A pozitivitás határértéke a vizsgálatban 104 cpm A3, táblázatban az eredmények azt mutatják, hogy a nukleinsav-fragmensek sorozatát alkalmazó szendvics-hibridizálás alkalmas nemi betegségek diagnosztizálásához. A minták, amelyek negatívak a tenyésztési vizsgá-4. latokban, negatívak a szendvics-hibridizálási vizsgálatban is. 2. példa a ) Nukleinsav-reagensek sorozatai Cyto- 5 megalovírusból, és ezek előállítása A Cytomegalovirus diagnosztikájához alkalmas DNS fragmenseket készítünk Cytomegalovírusból (AD 169, ATCC VR-538)- 'CMV). A DNS-t ismert módszerekkel izo- 10 hiljuk és fragmensekké bontjuk. EcoRI I. íragmenst mintegy 9 kb mérettel, amelyet Spector és munkatársai határoztak meg (J. Virol. 42, 558—582 (1982)) izolálunk agaróz gélből elektroelúcióval, miután az EcoRI 15 restrikciós fragmenseket elkülönítettük méretük alapján. Az eluált DNS-t fenollal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Az így tisztított DNS-t T4 ligáz segítségével EcoRI enzimet alkalmazva kinyitott pBR325 plazmid 20 vektorhoz kötjük, és az így előállított rekombináns DNS-t E. coli K12 HB101 gazda-baktériumba visszük át. Az ampicillinre és tetraciklinre rezisztens, de klóramfenikolra érzékeny kiónok közül egyet választunk ki, amely 25 a korrekt méretű, Cytomegalovírusra fajlagos DNS beiktatást tartalmazza. A klónozott Cytomegalovirus DNS jellemzőit Southern-folt módszerrel derítjük ki. Ez a vizsgalat bebizonyítja, hogy a leírt 9 kb-s EcoRI- 3Q -DNS fragmens Cytomegalovirus DNS-bőI származik, és még jellegzetesebb módon, Hrnd III-D fragmensében van belefoglalva (Oram és munkatársai: J. Gen. Virol. 59, 111 —129 (1882)). Az így leírt rekombináns 35 plazmidot pKTH1271-nek neveztük el, ez a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen tenyészet-gyűjteményben letétbe helyeztük D3M 2826 számon. A rekombináns plazmidot ismert technikákkal növesztjük és tisztítjuk. 40 A további klónozásokat ismert technikákkal hajtjuk végre, vektorként pBR322 plazm dot és M13mp7 és M13mp8 fágokat alkalmazva. A 12. ábra mutatja be a mintegy 9 kt-s molekula-hosszal rendelkező pKTH1271 hibrid-plazmidot. A 12. ábrában bemutatott 45 ni kleinsav-fragmens sorozatot EcoRI, BamHI, Clal és PstI restrikciós enzimeket alkalmazva állítjuk elő. A 12. ábra bemutatja a restrikciós enzimek alkalmazásával nyert fragmen- 5Q seket, valamint azok relatív méretét és elhelyezkedését. A 4. táblázat felsorolja a szóban fo-gó fragmensek méretét és a további klónozáshoz alkalmazott vektorokat, az így nyert rekombinánsok nevét, valamint alkalmazásukat vagy szűrőreagensként, vagy jelzett vizsgáló mintaként. A 13. ábra mutat be egy szendvics-hibrid sorozatot, amely akkor keletkezik, amikor a 4. táblázatban felsorolt nukleinsav-fragmensek sorozatát alkalmazzuk. Táblázat 16 Restrikciós fragmens Vektor Név Alkalmazás ai EcoRI-PstI /3,3 kb/ a2 Clal-BamHI /3,0 kb/ pBR 322 pKTH1273 Szűrő pBR 322 pKTF1274 Szűrő 9
