194938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás javított nukleinsav-reagensek előállítására
27 194938 28 13. Táblázat Kísérlet száma Beteg száma Hibrídizált radioaktivitás HPV mennyisége Folt-vizsgálat HPV11 2 1 10676 >107 + 2 2 7700 >107 + 2 3 3590 >107 + 2 4 234 1,5 -10 5-2 5 228 1,5 ’105-1 6 43 <105 — A pozitivítás határa a háttér kétszerese 79 cpm (1. kísérlet, vagy 144 cpm (2. kísérlet). A lizált HEF sejtek (10 vizsgálat átlaga) 39 cpm-et (1. kísérlet) vagy 100 cpm-et (2. kísérlet) mutatnak. A tanulmány azt demonstrálja, hogy a nukleinsav-reagensek sorozata 1—3 *10® kimutathatósági határnál megbízható diagnosztikai módszert képvisel HPV 11-hez. 5. példa a.) Nukleinsav-reagensek sorozata humán 16. típusú papillómavírusból, és ennek előállítása A BamHI helynél pBR322 plazmidban klónozott, 7,9 kb-s humán 16. papillomavirus (HPVT6) DNS-t emésztjük PstI restrikciós enzimmel, és a frakciókat elkülönítjük és izoláljuk ismert módszerekkel. A kiónt a German Cancer Research Centertől (Német 20 Rákkutató Központ) kapjuk, Heidelbergből, dr. Gissman Lutz-tól. A 20. ábra mutatja be a fragmensek relatív méretét és kölcsönös elhelyezkedését. A szubklónozást ismert technikákkal hajt- 25 juk végre, vektorként pBR322 plazmidot és M13mpl0 fágot alkalmazva. A 14. táblázat felsorolja a szóban forgó fragmensek méretét, a szubklónozáshoz alkalmazott vektorokat, a rekombináns plazmi- 30 dók nevét, és ezek alkalmazását. A 21. ábra a szendvics-hibrid reagensek sorozatát mutatja be, amely akkor keletkezik, amikor a 14. táblázatban felsorolt fragmenseket alkalmazzuk. 14. Táblázat Fragmens Méret Vektor Rekombináns plazmid Alkalmazás ai Pstl-PstI 1,7kb M13mp10 mKTHl378 Szűrő a2 Pstl-PstI 1,7kb M13mp 10 mKTH1379 Szűrő a2 Pstl-PstI 1,1kb M13mp10 mKTI11380 Szűrő az Pstl-PstI 1,1 kb M13mp 10 mKTH1381 Szűrő bi BamHI-PstI 0,6kb pBR322 pKT-11375 Vizsgáló minta b2 Pstl-PstI 2,7kb pBR322 pKTH1371 Vizsgáló minta b 3 Pstl-PstI 0,5kb pBR322 pKTH1376 Vizsgáló minta b.) Nukleinsav-reagensek sorozata érzékenységének bemutatása humán 16. típusú papillómavírushoz, szendvics-hibridizálási módszert alkalmazva A nukleinsav-fragmensek sorozatának érzékenységét úgy vizsgáljuk meg, amint ezt az lb'. példában leírtuk, olyan szűrőket alkalmazva, amelyek 10" mKTH1378, mKTH1379 molekula DNS-t (a,) és mKTH1380, mKTH 1381 molekula DNS-t (a?) tartalmaznak gQ A minta 16. HPV genomja, és a 14. táblázatbar felsorolt jelzett vizsgálómintákat alkalmazunk. A 15. táblázatban bemutatott eredmények azt jelzik, hogy a HPV16-hoz készített nukleinsav-reagensek sorozata ötször olyan érzé- 65 kény, mint egy egyedi reagenspár. 15
