194937. lajstromszámú szabadalom • Stabil glükóz-izomeráz koncentrátum és eljárás az előállítására

got elválasztjuk és kívánt esetben többször átkristályosítjuk,

c) a kapott kristályos anyaghoz szénhidrátot vagy annak tömény vizes oldatát adagoljuk, amikor is stabil, koncentrált glükóz izomeráz készítményt nyerünk.

A találmány értelmében az izomeráz enzim tisztítását igen hatásosan végezhetjük sóoldatból való kikristályosítással. Erre a célra bármely nem-toxikus só alkalmazható, amely az enzimet nem dezaktiválja. Előnyösen ammonium- és/vagy magnézium-szulfátot használunk.

A glükóz izomeráz sóval történő kicsapása ismert eljárás (Agr. Bio. Chem. 29, (1965), 1129—1134).

Az eddig ismert eljárások egyikében sem nyertek azonban megfelelő kristályos terméket, általában amorf termék vált ki minden

esetben.

A kicsapás körülményeitől függően, ugyanazon ammonium- vagy magnézium-szulfát felhasználásával, vagy amorf vagy kristályos izomeráz képződik. Ismert, hogy számos más fehérje is hasonlóképpen viselkedik.

A találmány szerinti eljárás fontos és nem várt jellemzője, hogy az izomeráz kristályos formában, minden más anyagot megelőzően válik ki, és az a kiválás szigorúan megválasztott körülmények között, alacsony ammónium-szulfát koncentráció mellett megy végbe, és más anyag az oldatból nem válik ki. Ily módon a találmány szerinti eljárás minden eddigi eljárástól különbözik, mivel azoknál sem a kristályos állapot, sem a kísérő anyag nélküli kiválás nem volt biztosítható. További előnye az eljárásunknak, hogy igen jó kitermelés érhető el.

Általában ismert, hogy az enzimkészítmények stabilitása és tárolhatósága, például glicerin, polialkoholok vagy cukrok adagolásával növelhető. Ezeket az anyagokat általában a koncentrált enzim oldathoz adagolják.

Azt találtuk, hogy ha a koncentrált, 10 000 GlU/g aktivitású kristályos izomerázt tartalmazó szuszpenzióhoz vagy magához a kristályos anyaghoz, vízmentes poli - alkoholt vagy cukrot, előnyösen glükózt adagolunk, a kristályos izomeráz feloldódik és tiszta, valódi oldatot nyerünk. A kapott oldat stabil, ha a víztartalma megfelelően alacsony és az izomeráz aktivitása megfelelően magas. Az oldat tartalmazhatja a kristályosítási folyamatnál használt sókat, amely sók előnyösen befolyásolják az izomeráz mikrobiológiai stabilitását. A cukroknak és polialkoholoknak igen jelentős szerepük van az izomeráz kristályok oldásában és így az oldat aktivitásának növelésében.

Az irodalomban eddig ismert izomeráz koncentrátumok egyikénél sem, valamint az ismert eljárások egyikével sem biztosítható olyan nagy aktivitás, mint a találmány szerinti készítményeknél.

5

A glükóz izomeráz koncentrátum előállításánál a következőképpen járunk el:

a) Streptomyces rubiginosus mikroorganizmusból lízissel sejtfolyadékot készítünk (4 410 627 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás), majd ebből ultraszűréssel állítjuk elő a szükséges kiindulási anyagot; előnyös izomeráz - koncentráció: 200— 800 GlU/g,

b) az izomeráz oldat pH-tartományát 5,7—8,0 közötti értékre előnyösen 7,0 értékre beállítjuk;

c) az oldatot 16°C-ra vagy még alacsonyabb értékre lehűtjük;

d) ammonium- és/vagy magnézium-szulfátot adagolunk az oldathoz, előnyösen 50— 170 g/liter mennyiségben. A só mennyisége függ a kiindulási izomeráz koncentrációjától, valamint a kristályosítás végső hőmérsékletétől. Legelőnyösebben olyan mennyiségben adagoljuk a szulfát-sót, amelynél csak az izomeráz kristályosodása indul meg és a többi fehérje még nem válik ki;

e) a szulfát-só adagolását előnyösen részletekben, kb. 2—4 óra alatt végezzük, bár a kívánt eredményt érjük el a só egyszerre történő adagolásával is, csak ilyenkor a kristályok szemcsemérete kedvezőtlenül kicsi;

f) a kapott oldatot előnyösen több órán keresztül hütjük, előnyösen a fagyásponthoz közeli hőmérsékleten. Ez az érték a vizsgálatok szerint —2 és —6°C közötti érték. A hűtést végezhetjük egyidejűleg a szulfát-só adagolásával vagy az adagolás befejeztével is, szerepe a nagyobb méretű kristályok biztosítása, az oldhatóság csökkentése és a kitermelés növelése;

g) az izomeráz kristályokat elválasztjuk, szedimentálással, szűréssel vagy különösen előnyösen folyamatos elválasztással centrifugálás útján;

h) az elválasztott kristályos anyagot vízmentes szénhidrátban vagy annak koncentrált vizes oldatában oldjuk, és ily módon stabil glükóz-izomeráz koncentrátumot nyerünk.

Kívánt esetben a kristályosítást megismételjük. Ekkor a kristályos anyagot a g) lépés szerinti elválasztás után viszonylag magas hőmérsékleten (20—30°C) vízfeleslegben feloldjuk, a vízmennyiséget úgy megválasztva, hogy az izomeráz aktivitása 500—2000 GlU/g legyen. Ez a vízmennyiség általában 4—10- -szerese a kristályos anyag mennyiségének.

A következő példákkal a találmányt közelebbről illusztráljuk.

1. példa

40 m3-es fermentorban Streptomyces rubiginosus mikroorganizmust fermentálunk (4 410 627 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) a sejtfolyadékot lízissel elválasztjuk, a sejteket és más szilárd anyagot kovaföldön leszűrjük, amikor is 32 tonna izomeráz-tartalmú szűrletet nyerünk. A szürleteí ezután ultraszűrjük (PCI, Patterson-Candy Inc.), ekkor 3000 kg izomeráz-tartalmú koncentrátumot nyerünk, aktivitás 960 000 000

6

194937

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

4