194937. lajstromszámú szabadalom • Stabil glükóz-izomeráz koncentrátum és eljárás az előállítására
194937 A találmány kémiailag és mikrobiológiailag, mikroorganizmusok adagolása nélkül is stabil glükóz izomeráz enzim-koncentrátumra és előállítási eljárására vonatkozik. E koncentrátumokat az enzimek hordozókon való immobilizálására használják. A glükóz glükóz izomerázzal fruktózzá való izomerációja ismert ipari folyamat, amelyet általában az enzim immobilizált formájában végeznek. Az ismert technológiai eljárások során az immobilizált enzimet egy külön folyamatban készítik, amely során vagy az enzimet rögzítik a hordozóhoz valamely adszorpciós eljárás segítségével, vagy a teljes mikróbás sejttömeget rögzítik a mátrixhoz az enzimmel együtt. A reakció-oszlopot az immobilizált enzimmel töltik meg és amikor az enzim felhasználódott, az oszlopot kiürítik, majd újra feltöltik friss, immobilizált enzimkészítménnyel. Nyilvánvaló, hogy igen gazdaságos lenne, ha az oszlopon lévő inaktiválódott enzimet valamely regenerációs módszerrel ismét aktiválni lehetne. Ily módon csökkenteni lehetne a hordozó szennyeződését, továbbá elkerülhető lenne az immobilizált enzim-készítmények hatásosságának csökkenése.Ha az enzimek immobilizálását közvetlenül az oszlopban lévő hordozón végezhetnénk, kiküszöbölhető lenne az enzimek szárítása és mechanikus kezelése, amely során az enzimek sok esetben károsodnak. A jelenlegi ismert megoldások szerint inkább a tisztított, mint a nem-tisztított készítményeket, enzimeket adszorbeálják a hordozókon. (4 347 322 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás), és általában problémát jelent a stabil, könnyen kezelhető és tárolható, közvetlenül a hordozón immobilizálható enzim-készítmény előállítása. A kicsapással vagy kristályosítással tisztított glükóz izomeráz készítmények legalább 60 t% vizet tartalmaznak, amelyet az enzim szerkezetének megbontása nélkül nemigen lehet eltávolítani. Továbbá, az így nyert kristályos anyag mikrobiológiailag instabil, kezelése és adagolása nehézkes. Más eljárások szerint a kristályos anyagot vízben vagy sóoldatban oldják, és a cél az lenne, hogy tárolási, stabilitási és szállíthatósági szempontokból az oldat koncentrációja minél nagyobb legyen. A gyakorlat azonban azt mutatja, hogy az enzim korlátozott oldhatósága miatt a tömény oldatok készítése nehéz, a híg oldatok stabilitása viszont kicsi, és aktivitásuk mikrobiológiai és kémiai bomlás révén rövid idő alatt lecsökken. Ezek kiküszöbölésére javasolták, hogy az enzimet szerves oldószerben oldják (4 077 842 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Ezek az enzimek azonban közvetlenül élelmiszerek előállítására nem használhatók. A szakirodalomban igen sok eljárás ismert a glükóz izomeráz készítésére és tisztítására vonatkozóan, mivel ez egyike a gyakorlatban 1 2 legelterjedtebben használt enzimkészítményeknek. Az ismert eljárások azonban meglehetősen körülményesek és igen alacsony a kitermelésük. Maga a kristályosítással történő enzimtisztítás jól ismert eljárás (pl. Enzymes, Dixon, M. és Webb, E.C., 3. kiadás, Longman Group Ltd., Bungay, 1979, 1116. oldal). Ismert továbbá, hogy ammónium-szulfát adagolásával sok esetben javíthatók a kristályosodás körülményei és csökkenthető az oldhatóság. Az ammónium-szulfáton kívül a kristályosítást más sók vagy szerves oldószerek, így például alkohol vagy aceton alkalmazásával is kivitelezhetik. A kémia ezen területén azonban elfogadott tény, hogy előre nem kiszámítható, hogy egy enzim vagy fehérje va'amely önmagában ismert szer segítségével kristályosítható. Számos olyan enzim vagy fehérje ismert, amelynek kristályosítása a biokémiai eljárásokban végbement nagyarányú fejlődések ellenére sem megoldott. A glükóz izomeráz tisztítására alkalmas frakcionált szulfát-kicsapásos eljárás számos publikációból ismert (4 237 231 és 4 077 842 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások, Agr. Biol. Chem., 45 (1981), 619— 627; u. ott 28, (1965) 1123—1128; u. ott 34, (1970) 1795—1804; u. ott 29, (1965), 1129— 1134; Biophys, Acta, 151, (1968), 670—680). Ezeknél az eljárásoknál azonban a szulfát-koncentráció általában igen magas. Így pé’dául a 4 237 231 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint a szükségtelen fehérjék kicsapására 40%-os ammónium-szulfát oldatot használnak, míg magát az izomerázt még töményebb oldat (min.60%-os) alkalmazásával csapják ki. Ha a frakcionált kicsapáshoz tömény ammónium-szulfát oldatot használnak, az izomerázzal együtt egy sor másik fehérje is kicsapódik, és minél több más fehérje van jelen, annál koncentráltabb ammónium-szulfát oldat szükséges. Ez csak úgy kerülhető el, ha az izomerázt valamely egyéb eljárással mór tisztították. A frakcionált kicsapáson alapuló eljárásoknál általában amorf terméket nyernek, amelyet igen nehéz, sok esetben lehetetlen jó kitermeléssel elválasztani az anyalúgtól az ipari méretekben általában használatos centrifugálásos vagy egyéb elválasztási eljárásokkal. Az így kapott amorf anyag általában keverék, amely az izomerázon kívül más fehérjéket is tartalmaz, ha a nyers kiindulási anyag nem tisztított, mikróbás sejt-folyádék volt. Az ilyen amorf anyagok elválasztása az anyalúgtól nehézkes és izomeráz szempontjából nem ad kielégítő tisztaságú terméket. Az ammónium-szulfáttal, más sókkal vagy szerves oldószerekkel végzett glükóz izomeráz kristályosítási eljárás szintén ismert (Biochem. Biophys. Acta, 151, (1968), 67— 680; Agr. Bioi. Chem. 34, (1970), 1795.1804; 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
