194741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás NMR felvételhez használható kontrasztanyagok előállítására
7 194 741 8 kezik. Ez a csökkenés amiatt lép fel, minthogy a vízmegkötő helyeknek a DTPA funkciós csoportjai által okozott ellépését részben egyensúlyozza a komplex növekvő forgási relaxációs ideje. A DSPC-koleszterin vezikulákban zárványositott Gd-DTPA komplexekkel az oldat 1/T, értéke 2,5 s"'-es értékre növekszik 1,0 mM teljes Gd-DTPA-ra. Bár a szabad Gd-DTPA-nál kevésbé hatásosan, de a vezikulák szintén lényegesen befolyásolják a víz relaxációját. A 3. ábra mutatja paramágneses ion-komplexek koncentrációjának hatását a vezikulába zárványositott Gd-DTPA relaxációs sebességére. A vezikula oldatok 1/Ti és 1/T2 értéke a Gd-DTPA koncentrációval lineárisan nő egészen 150 mM-ig. A következő egyenlet, _J_______Eh__, _L T, kis. (T,b+rb) T,a’ ahol b a vezikula belsejét és a a külső részt jelöli. rt> a belső víz protonjainak élettartama, T,b a belső víz tiszta relaxációs ideje (a paramágneses reagens jelenléte miatt kis érték) és Pb a víz aránya a vezikulán belül, 1/ Trnek a paramágneses ion koncentrációjától való lineáris függését jósolja mindaddig, míg T, értéke el nem éri vagy kisebbé nem válik rt> értékénél. A 3. ábrán látható eredmények azt sugallják, hogy egészen 150 mM Gd-DTPA koncentrációig a vezikulán belüli T, érték meghaladja a b kicserélődési élettartamot. Az egér szövetében és daganataiban tapasztalt relaxációs hatásokat a 4. ábra mutatja. A Balb/c egér máj, lép, vese és EMT6 daganatos szöveteinek T, értékeit vetjük össze. 16 órával a paramágneses reagensek, illetve a kontroll anyagok beinjektálása után megállapíthatjuk, hogy a vezikulába ágyazott Gd-DTPA lép és EMT6 daganatok esetén elősegíti a T, érték szignifikáns csökkenését. Kontrollként, lép esetén a diamágneses La-DTPA vezikulába zárványositott komplexét, daganat esetén PBS puffert és PBS puffer plusz 2,0-t alkalmaztuk. A Gd/DTPA-vezikulákkal kezelt egerek esetén az átlagos T, értékek 17%-kal kisebbek a nem kezelt kontroll állatokban mérhetőknél. A megelőző adatok lehetőséget teremtenek a minimális Gd/DTPA vagy más paramágneses specieszek vezikulán belüli azon minimális koncentrációjának becslésére, mely már kontrasztnövelést eredményez. A hatáskiváltó tényezőknek komplex sora állítható fel, melyben szerepel a daganatos sejtek membránjain keresztül történő protonkicserélődés sebessége, a szabad Gd/DTPA-nak lipid vezikulákból való kimosódási sebessége, valamint a makromolekulás környezetben lévő komplex módosult forgási korrelációs ideje, amely befolyásolja a proton T, relaxációs sebességét és így a kontraszt növekedését. A vizsgált szövetben felhalmozódó vezikulák mennyisége határozza meg a zárványositott paramágneses anyag minimálisan szükséges koncentrációját. Egérdaganati modellre bizonyították, hogy a daganat térfogatának közelítően 0,1%-a betöltött intakt vezikulákkal. Míg a zárványositott paramágneses anyag pontos mennyisége változhat a használt anyag minőségétől és a fent említett tényezőktől függően, általában igaz, hogy a paramágneses anyag mennyiségének el kell érnie a vezikulánkénti 50 Mm-t. A maximális mennyiséget az ár, a toxicitás és a vezikula szerkezete határozza meg, de rendszerint nem magasabb 1 M zárványosítási koncentrációnál. Az 5. ábra mutatja be a polimer hozzáadása miatt megnövekedett relaxációs sebességeket. A Gd-DPTA relaxációs hatása növelhető a pozitív töltésű polimer, a poli-L-lizin hozzáadásával. Az 5. ábrán látható a 25 000 átlagos molekulatömegű poli-L-lizinnek 2,0 mM Gd- DTPA-t tartalmazó vizes oldathoz való hozzáadásának eredménye. Az 1/T, relaxációs sebesség 40%-kal, míg 1/T2 30%-kal növekedik. 3 mg/ml-es szint fölött adagolt poli-L-lizin hatására már csupán „gyenge kötődés” jön létre. Ez a kikapcsolási jelenség szintén azt mutatja, hogy a relaxációs sebesség növekedése nem a viszkozitás növekedésének tulajdonítható. Ugyanis ez a hatás a teljes koncentrációtartományban lineárisan változna a poli-lizin adagolásával. A kisebb molekulatömegű poli- L-lizin kevésbé hatásos. A Gd-DTPA negatív töltésű komplex, amely reverzibilisen kötődik a pozitív töltésű poli-lizinhez. A makromolekula nagy mérete és ebből következő lassú mozgása hatásosabbá teszi a paramágneses ion relaxációját. Ez a hatás használható ki a Gd- DTPA és a poli-lizin vagy más pozitívan töltött makromolekula együttes zárványosításával, mely esetben nő az egységnyi Gd-ionra eső hatás és így csökken a végtermék nettó toxicitása. Az EMT6 tumorokon mért relaxációs effektus időlefutása látható a 6. ábrán. A vezikulában zárt Gd- DTPA a maximális hatást a reagens injektálása után 3-4 órával éri el. A 4 óra elteltével tapasztalt átlagos hatás közelítően azonos az injektálás után 16 órával mérhető hatással, ami sugallja, hogy a rendszer egyensúlyi állapotba kerül, ahol a daganat okozta sebességnövekedést a vérkeringésbe kerülő anyagveszteség kompenzálja. A 6. ábrán feltüntetett kísérleteknél alkalmazott dózisnál magasabbat használva, három különböző liposzómának Balb/c egerek bőr alá implantált EMT6 daganataira gyakorolt hatását teszteltük. Az egerekbe intravénásán injekcióztuk a reagenst, majd meghatározott időközönként megöltük őket. Mértük a daganati és máji T, értékeket, az állat megölésétől számított fél órán belül. A daganatokra vonatkozó eredményeket az I. táblázatban, a májra vonatkozókat a II. táblázatban tüntetjük fel. A csupán puffert kapó állatok átlagos daganati T, értéke 960±41 ms (n = 25), míg az átlagos máji T, értéke 392±31 ms (n = 24). Az 1:1 arányú DSPC/CHOL alkalmazása esetén az injektálás után 24 órával a daganati relaxációs idő 665±28 ms-ra (n = 4) csökkent, míg ugyanezen állatok átlagos máji T, értéke 370± 13 ms (n = 4) volt. Tehát daganatok esetén a T, érték 44%-os változása lényegesen meghaladja a májra vonatkozó csökkenés mértékét (6%). Az általánosan használatos sokféle liposzóma alkalmazása során a tapasztalatok szerint a máj (és a lép) akkumulálja a vezikuladózis döntő részét. A jelen találmányban megadott különleges összetételű anyag így daganat-specifikus, legalábbis az NMR relaxációs időre gyakorolt hatását tekintve. A jelen találmányban megadott, vezikulába ágyazott paramágneses komplex kielégíti az NMR-elvétel kontrasztanyag iránti igényét; azaz bizonyos szövetekben a T, idő redukcióját okozza. Jelen esetben a kontrasztanyag alkalmazása előtti eredendően hosszú daganati T, idő (átlaga 960 ms) az NMR-felvételen sötéten hagyja a daganatot, míg a reagens injektálás után a daganat világosan megjelenhet vizsgálatkor. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
