194741. lajstromszámú szabadalom • Eljárás NMR felvételhez használható kontrasztanyagok előállítására
kapcsolódnak. Bár beszámoltak arról, hogy a kimetszett szív T! relaxációs idejének szelektív csökkentése érhető el mangánnal jelölt monoklonális antimiazin antitestekkel (lásd Brady és munkatársai „Infravörös miokardium relaxációs idejének szelektív csökkentése mangánnal jelölt monoklonális antitestekkel” című cikkét, Soc. Magn. Rés. Med., Works in Progress, Second Annual Meeting, 1983,10. oldal), mindazonáltal főleg olyan megfontolások alapján, mint az előzőekben említett toxicitás, az ilyen antitestek gyakorlati alkalmazása igen korlátozott mindmáig. Jelen találmány alkalmazása esetén az érzékenység növekedése mellett a specifikusság is megmarad, az antitestnek a micelluláris testecskék felületéhez való kapcsolódása miatt. Az antitestek nagyfokú specifikusságot biztosítanak bizonyos sejt vagy szövettípusokra, míg a kapcsolódó vezikula hatóanyag-hordozók azon szint fölé emelik az NMR-kontrasztot, mely csupán az antitesthez kötődő ionok által lenne elérhető. Az itt leírt találmány olyan micelluláris testecskék előállítására irányul, mint a kicsi unilamelláris hólyagocskák, melyekhez valamilyen paramágneses anyag asszociálódik, tipikusnak tekinthető esetben a paramágneses vegyületeket a vezikulák zárványosítják. A vezikulák antitestekkel is rendelkezhetnek, mint például az antimiozin vagy az antifibrin, melyek vagy a felületükhöz kapcsolódnak, vagy olyan felületi módosulást okoznak, melyekre specifikus sejtreceptorok találhatók bizonyos szövetekben. A vezikulaalkotókra példák az olyan foszfolipidek, mint a DSPC (disztearil-foszfatidil-kolin), a DPPC (dipalmitil-foszfatidil-kolin) vagy a DMPC (dimirisztilfoszfatidil-kolin). A paramágneses anyagok olyan átmeneti fémek, aktinidák és lantanidák sói, mint a Gd(III), a Mn(II), a CU(II), a Cr(III), a Fe(II), a Fe(HI), a Co(II), az Er(III) és a Ni(II), valamint ugyanezen ionok komplexei DTPA-val (dietilén-triamin-pentaecetsav), EDTA-val (etilén-diamin-tetraecetsav) és egyéb ligandumokkal. Más paramágneses vegyületek szabad gyököket tartalmaznak, mint például a szerves nitroxidok. A vezikulákba zárványosított kontrasztanyagok előállíthatok, ha megfelelő módon eloszlatjuk a Iipid vezikulákat a paramágneses reagenst tartalmazó vizes oldatban, például szonikációval, homogenizálással, kelát dialízissel, illetve egyéb módszerekkel, majd megszabadítjuk a vezikulákat a reagensektől ultraszűréssel, gélszűréssel vagy más hasonló eljárással. A továbbiakban a paramágneses anyag oldata úgy módosítható, hogy az egységnyi reagens relaxációs sebessége maximális legyen, mely cél elérhető például egy töltött polimerrel (például poli-L-lizinnel) való összekapcsolással. A jelenlegi szóhasználat szerint a „micelluláris testecske” és a „micellák” olyan részecskéknek felelnek meg, melyek amfifil molekulák aggregációjakor képződnek. Jelen találmányban ezen amfifil vegyületek a biológiai lipidek. A „vezikula” olyan micellát jelent, mely többnyire gömb alakú, és gyakran olyan lipidből nyerhető, mely kettősrétegű membránt alkot és általában „liposzómaként” emlegetik. Az ilyen vezikulák előállítási módszerei manapság rendkívül jól ismertek. Tipikusan foszfolipidekből állítják elő őket, például disztearil-foszfatidil-kolinból vagy lecitinből, jellemzőjük, hogy más anyagokat is tartalmazhatnak, például neutrális lipide-3 két, valamint felületmódosító, többnyire pozitív, illetve negatív töltésű vegyületeket. Az előállítási technikától függően a burkoló felület lehet egyszerű kettősrétegű gömbhéj (unilamelláris vezikula) vagy többszörös rétegű (multilamelláris vezikula). DSPC = disztearil-foszfatidil-kolin Ch = koleszterin DPPC = dipalmitil-foszfatidil-kolin DMPC = dimirisztil-foszfatidil-kolin DTPA = dietilén-diamin-pentaecetsav EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav SUV = kicsi unilamelláris vezikula A paramágneses vegyületek komplexei ioncserélt vízben vagy pFI = 7,4-es (PBS) pufferben (4,0 mM Na2HPO„ 0,90% NaCl) készültek. Gd(III)-citrát. Az 1,0 mM Gd(III)-10,0 mM citrát törzsoldata úgy készült, hogy 10,0 /miól GdCl3. 6H20 (99,999%, Aldrich)-t oldottunk 9 ml ioncserélt vízben, majd hozzáadtunk 100 mól Na2-citrátot (analitikai minőség, Mallinckrodt). A pH-t semlegesig változtattuk, a térfogatot 10,0 ml-re egészítettük ki mérőlombikban. Mn(II)-citrát. Az 1,0 mM Mn(II) 10,0 mM citrát törzsoldata úgy készült, hogy 9 ml vízbe 10,0 ^mól MnClj. 4H20 (analitikai minőség, Baker)-t és 100 /rmól Narcitrátot adagoltunk. A semleges pH elérése után a térfogatot 10,0 ml-re egészítettük ki mérőlombikban. Gd(III)-DTPA. A 200 mM Gd(IH)-210 mM DTPA törzsoldata úgy készült, hogy minimum 6NNaOH-ban 2,1 mmól DTPA-t oldottunk 10 ml-es mérőlombikban. 2.0 mmól GdCl3.6H20-t adtunk hozzá, majd 6N NaOH-dal beállítottuk a pH-t 7,4-re. Ezután a mintát jelre töltöttük. La(III)-DTPA. A 200 mM La(III)-2I0 mM DTPA törzsoldata a Gd(III) DTPA-oldattal analóg módon készült, LaCl3.7H20 (99,999%, Aldrich) felhasználásával. Er(IlI)-EDTA. A törzsoldat a Gd(III)-DTPA előállításánál megismert módon készült. Poli-L-lizin-hidrobromid. A közelítőleg 25000 és 4000 átlagos molekulatömegű minták a Sigma Chemical Co-nál készültek. Koleszterin. Mallinckrodt gyártmány (98%). DSPC. A Cal-Biochem. szintetikus anyaga. DSPC/koleszterin vezikulába zárványosított kontrasztanyag 16 mg DSPC-t és 4 mg koleszterint oldottunk 2 ml CHCl3-ban. 0,16 mM koleszterin CHCl3-as oldatának 10 /rl-ét [u-14C] (56,5 mCi/mmól) adagoltunk hozzá abból a célból, hogy a végső preparátumokban a lipid-koncentráció kvantitatívan mérhető legyen. A lipidoldatot vákuum exszikkátorban szárazra pároltuk, ily módon a tesztcsőben egy lipidfilm képződött. Nem azonnali felhasználás esetén az anyagot ugyanott tároltuk. A kicsi unilamelláris vezikulák (SUV) előállítása 200 mM Gd(III)-DTPA oldatban történt, az ionkomplex 2.0 ml mennyiségű a leírt módon előállított törzsoldatának a fenti módon nyert, tesztcsőben lévő lipidfilmhez való hozzáadásával. Az oldat hozzákötődött a lipidfilmhez. A keveréket Ultrasonics Inc. szondával szonikáltuk, 56 W-os mikrohegy alkalmazásával. A cső hűtése vízfürdőbe való részleges bemerítéssel lett megoldva, a szonikáció nitrogén atmoszféra alatt történt. A szonikáció teljes ideje 15 perc vagy több volt, addig tartott a szonikáció, míg az oldat enyhén opálossá nem vált. A vezikulán kívüli paramágneses reagens elválasztá-1 4 194 74 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
