194584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag és az erre fajlagos, hordozóhoz kötött monoklonális antitestek előállítására
1 194 584 tesz tumort hagyjuk azokat osztódni. A másik módszer szerint a sejteket nagy lombikban tenyésztjük, szérummentes tápközegben. Az aszciteszt vagy a tenyészet felülúszóját amnrónium-szulfáttal vagy ultraszűréssel koncentráljuk, és az immun-globulin t ioncserélő gyantás kezeléssel — például DEAE—Sephadex-szel — vagy proteinA-cellulózzal eltávolítjuk. 3. A TF tisztítása affuiitási kromatográfiás eljárással A tisztított immun-globulint bróm-cianiddal aktivált hordozóhoz — például Agarose-hoz vagy Sepharosehoz — kötjük, majd megfelelő térfogatú oszlopba töltjük. Az oszlopon átfolyatva a J774.1 sejtek sűrű tenyészetének felülúszóját, csak az ATF kötődik a töltethez, melyet azután az ionkoncentráció növelésével eluálunk, tiszta ATF-et kapva. 4. A TF mennyiségének meghatározása jelzett antitesttel j A fenti módon előállított antitestet jóddal jelezve az ATF-tartaimat gyorsabban meg tudjuk határozni, mintha az aktivitást biológiai módszerrel mérnénk. Az 1. ábrán az ATF eluciós profilja látható, TSKDEAE-3SW töltetű oszlopon végzett nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással meghatározva. Az 5. példában a TSK-G3000-SWG töltetű oszlopon kapott ATF frakciót TSK-DEAE-3SW töltetű oszlopon tisztítjuk. 0,6 ml/perc átfolyási sebesség mellett 1,2 ml-es frakciókat szedünk. A 2. ábrán a tisztított ATF poliakrilamid gélelektroforézis profilja látható. A gélt Coomassie Brilliant Blueval festjük. A többi gélt 5 mm-es sávokra vágjuk, RPMI- 1640 táptalajjal extraháljuk és mérjük az ATF-aktivitást az extraktumban. Az 1. fénykép a 4. kísérletben ismertetett vérzéses nekrózist mutatja egéren. A baloldali kép a kontroll állatot, a jobboldali felvétel a kezelt állatot mutatja, 24 órával az 1A. példa szerint előállított felülúszóval való injektálás után. A 2. fénykép a 4. kísérletben ismertetett Meth—A tumorszövet hisztológiai preparátumát mutatja. A felső képen a kontroll egérből nyert Meth-A tumor, az alsó képen az 1 A. példa szerinti felülúszóval injektált egérből preparált Meth-A tumor látható. Az első képen látható 4 a tumorsejtek körül a limfocita-szerű sejtek beszűrődése, ami a sejt pusztulását jelzi. A 3. fényképen a 4. példában ismertetett teljes gyógyulás látható. A baloldali képen a kontroll állat, a jobboldali képen az 1A. példa szerint előállított felülúszóval kezelt állat látható. 2 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag - amely A) L-929 egér tumorsejtek ellen erős citotoxikus hatást mutat, de normális sejtekre — például humán magzati fibroblaszt-sejtek, humán felnőtt bőr fibroblasztsejtek vagy aranyhörcsög fibroblaszt-sejtek (Don, V—79) - nem citotoxikus, azaz in vitro nagy tumor-spectfitással rendelkezik; B) Meth—A szarkomával szemben in vivo erős tumorellenes hatást mutat, és a gyógyult állat immunitást szerez az újabb transzplantációval szemben; C) nyulaknak intravénásán injektálva nem fejt ki lázkeltő hatást; D) molekulasúlya 45.i)0d±5 000, Sephacrÿl S-200-on végzett gélszűréssel meghatározva; E) izoelektromos pontja (pl) 4,8±0,3 - előállítására, azzal jellemezve, hogy J 774.T tumorsejteket magzati borjúszérumot tartalmazó komplett tápközegben tenyésztünk, a sejteket szérummentes tápközegben továbbtenyésztjük, és a tenyészet felülúszóját elválasztjuk, és kívánt esetben tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás tisztítási lépése nagy tisztaságú, tumorgátló hatású, fehéijeszerű anyag előállítására, azzal jellemezve, hogy szérummentes tápközegben tenyésztett sejtek felülúszóját ammónium-szulfáttal kicsapjuk, a csapadékot Sephacryl S-200-on gélszűrjük, Blue-Sepharose-on kromatografáljuk, a nem-abszorbeálódott frakciókat összegyűjtjük és DEAE-Sephadex A-50-oszlopon átfolyatjuk. 3. Eljárás hordozóhoz kötött monoklónozott antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-2. igénypontok bármelyike szerint előállított tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyaggal és adjuvánssal szubkután injektált, majd intenzív immunizálásnak alávetett egérből nyert lépsejtek és P3— X63— Ag 653 egér mieloma-sejtvonal hibridizálásával nyert hibridoma sejtekből kapott monoklónozott antitestet megfelelő hordozóhoz kötjük. V"*” ' 5 10 15 20 25 30 35 40 45 4 db ábra
