194584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású, fehérjeszerű anyag és az erre fajlagos, hordozóhoz kötött monoklonális antitestek előállítására
1 194 584 2 2. kísérlet Az ATF in vitro citotoxikus hatását tumorsejtekre és normális sejtekre az 1. példa szerint előállított tápközeg, alkalmazásával határozzuk meg. Az 50 %-os sejtpusztü- 5 lást okozó hígítás nagysága humán tüdő pikkelyes sejt karcinomák (EAC-1) esetén 100-szoros, humán bőr pikkelyes sejt karcinoma (HSC—1) esetén 32-szeres. Másrészről normális humán diploid fibroblaszt-sejtekkel (IMR—90) és aranyhörcsög Don-sejtekkel szem- 10 ben nem tapasztalunk citotoxikus hatást, még akkor sem, ha a sejteket hígítatlan tápközeggel kezeljük. 3. kísérlet 15 A TF lázkeltő hatásának vizsgálata Az interleukin—1-gyei való összehasonlítás céljából 10 ml 1. példa szerint előállított tápközeget új-zélandi 20 fehér nyúl vénájába injektálunk, és mérjük a végbélben a testhőmérsékletet. Az injektálás után 1 órával 0,3 °C, 2 órával 0,1 °C hőmérsékletemelkedést észleltünk csak. A fenti eredmény szerint a találmány szerinti eljárással előállított anyag (ATF) nem rendelkezik lázkeltő hatással. 25 4. kísérlet Fine Chemicals) oszlopra visszük, és mindkét mintában megvizsgáljuk a molekulasúlyokban mutatkozó különbséget. Az oszlopot 0,03 mól/1 nátrjum-kloridot tartalmazó 0,02 rnól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrelfpH 7,5) ekvilibráljuk, és az ATF-et is a fenti oldattal eluáljuk. Az eluciós térfogatok között alig van különbség a két minta esetén. A fenti eredményből arra következtethetünk, hogy az ammónium-szulfátos frakcionálás hatására nem asszociálódik, sem más proteinekhez nem kötődik az ATF. 6. kísérlet A TF molekulasúlyának meghatározása Részlegesen tisztított ATF-et 2,5X85 cm-es Sephacryl S—200 (Pharmacia Fine Chem.) oszlopra viszünk, melyet 0,3 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,5) ekviiibráltunk. A molekulasúlyt az L-sejtekre nézve citotoxikus hatással rendelkező ATF-frakciók eluciós térfogatából határozzuk meg. Az oszlopot ismert molekulasúlyú anyagként riboiíukleáz A-val, kimotripszinogén A-val, ovalbuminnal, marhaszérum-albuminnal, kék dextránnal kalibráljuk. Az ATF molekulasúlya a fenti módszerrel meghatározva 45 000±5000. A TF in vivo tumorellenes hatása Beltenyészeti BALB/c egerek bőre alá a lágyék táján 106 Meth-A fibroszarkoma sejtet transzplantálunk. 7 nap múlva az egerekbe intravénásán 0,2 ml olyan tápközeget injektálunk, melyet az 1A. példa szerint előállí- 35 tott tápközeg koncentrálásával nyertünk (specifikus aktivitása 90 egység/mg protein). Az injekció utáni napon 2-3 mm átmérőjű vérzéses nekrózist figyeltünk meg a 19 vizsgált állat közül 17 állaton, azaz az állatok 89 %-ánál (1. fénykép). ' 40 A tumorok egyikének egy részét kimetszettük, abból a célból, hogy a tumor vagy a tumoros szövet környezetének hisztopatológiai változását megfigyeljük. A 2. fényképen látható, hogy a tumoros szövet környezetében sok olyan limfocita-szerű sejt van, amely 45 feltehetően a gazdasejtből származik. Ezután az idő előrehaladtával a Meth-A szarkoma mérete csökkent, különösen egyes esetekben volt jelentős a tumor nekrózis. A 7. napon a tumor kisebbedése mellett varképződést 50 észleltünk. A 10. napon a var levált, mint az a 3- fényképen látható. A fentiek szerint 19 állat közül 16 esetben (84 %) a tumor teljes mértékben eltűnt. A teljesen gyógyult állatok bőre alá újra Meth-A sejteket transzplantáltunk, de azok nem fogantak meg. A fenti eredmény 55 a szerzett immunitás létezésére utal. Ammónium-szulfát hatása az ATF tisztítására A 2. példa szerinti felülúszó folyadékot, valamint az 5. példában leírt, 0—65 %-ig telített ammónium-szulfátos frakciót 2,5 X 85 cm-es Sephacryl S-200 (Pharmacia 65 30 7. kísérlet ATF izoelektromos pontjának meghatározása Az izoelektromos pontot poliakrilamid gélelektroforézis módszerrel mérjük, Ampholine (pH tartomány: 3,5-7,0) reagens alkalmazásával (gyártja az LKB Co.). A gélt 5 mm-enként elvágjuk, desztillált vízzel extraháljuk és minden egyes extrahált frakcióban mérjük a pH-t és az L-sejtek elleni citotoxikus aktivitást. A vizsgálat eredménye szerint az ATF izoelektromos pontja (pl) 4,8±0,3. 1. példa A) ATF előállítása komplett tápközegben 20 % magzati boíjúszérummal (FCS) kiegészített RPMI-1640 táptalajt 3X 106 J774.I sejttel — melyet a japán National Institute of Health-től szereztünk be — beoltjuk, és 5 % szén-dioxid-tartalom mellett 37 °C-on tenyésztjük. A sejtek közül sok gömb alakot vesz fel, vagy egy réteget képez, és erősen kötődik a csésze aljához, miközben erőteljesen szaporodik. Mikor a tenyészetben kezdenek úszó sejtek is megjelenni, a sejteket az üveg felületéről leválasztjuk, és 10:1 arányban hígítva új csészébe helyezzük. A fenti tenyésztési időszakiján minden 3 -4. napon összegyűjtjük a tenyészet felülúszóját, amely a találmány szerinti anyagot tartalmazza. A fenti módszerrel 500 egység/ml titerű felülúszó folyadékot kapunk. B) Az L-sejtekkel szembeni citotoxikus aktivitás (titer) annál nagyobb, minél nagyobb a tenyészet sejtszáma, és minél hosszabb ideig folytatjuk a tenyésztést. Ha a J774.1 sejteket 1,4X 107 sejt/cm2 denzitás 4
