194496. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Marek-kór elleni élő vakcina előállítására
A találmány egy ismét másik tárgya olyan Marékkor víruskészitmény előállítása, amely képes megvédeni az ínokuált csirkéket Marek-kór vírusok virulens és nagyon virulens biológiai variánsai ellen. A találmány további tárgya egy olyan vírustörzsklón előállítása, amely a CVI-988 MDV-szülőtörzsből származik, de amely lényegesen kevésbé patogén anélkül, hogy immunogén tulajdonságait elvesztené. A találmány még további tárgya Marek-kór vírus 1. szerotípusú kiónjai családjának előállítása a sorozatos passzálással madársejt-tenyészetekben, és tarfolttisztítással, amely által olyan törzset lehet kiválasztani, amely a nem patogén, viszont immunogén tulajdonság kedvező kombinációjával rendelkezik. A jelen találmány tárgya nagy mértékben immunogén víruskészítmény előállítása, amely 1. szerotípusú madár-herpeszvírusok közé tartozó Marek-kór vírus élő vírusklónját tartalmazza, és amely készítményt az 1. szerotípusú madár-herpeszvírusok közé tartozó valamely Marek-kór vírus, előnyösen a CVI-988 MD-vírus madársejttenyészetben végzett sorozatos passzázsával nyerünk, és amely klón képes az említett klónnal inokulált csirkék védelmére az MD-vírusok virulens és nagyon virulens biovariánsai, mint pl. az MDV K, MDV GA-S, MDV RB/1B és MDV Tun, ismételt fertőzései ellen, és amely lényegében nem patogén az MD-re nagy mértékben érzékeny SPF RIR csirkékre sem. Kísérleti vakcina előállítása. A vírustörzset DEF-ben végzett 51 sorozat passzálás útján gyengítjük, beleértve hat tarfolt-tisztítási lépést is a 39. és 49. passzálások között, amelyben egy lokalizált citopatológiai változás (vírus tarfolt) vírusnyeredékét alkalmazzuk inokulumként. A „C” kiónt a végső tarfolt-tisztítási lépésnél nyeljük. Ilyen egyrétegű telepeket (mono-lager) inokuiálunk a vírus végponthígításaival, és az újonnan kialakított vírust in situ lokalizáljuk 0,85% agar hozzáadásával a tápközeghez. A CEF-hez való adaptálást úgy kapjuk, hogy váltakozva passzálunk CEF-ben és DEF-ben az 52. és 63. passzálások között, és ezután a sejttenyészetek passzálását CEF-ben végezzük. 3-5 napos tenyésztési idő után, az inokulumban levő vírus dózisától függően, fajlagos citopatológiai változások figyelhetők meg. A kacsaembrió-fibroblasztokat 13 napos, kacsatojásban kialakult embrió tripszines emésztésével nyerjük. Tenyésztőedényeket (Petri-csészék vagy Roux-palackok) oltunk be 0,8xl06 sejt/ml-t tartalmazó sejtszuszpenziókkal. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk olyan tápközegben, amelyben a C02 százalékos arányát 5%-on tartjuk. A növesztő tápközeg össze3 tétele a következő: Ásványmentesített víz 818 ml Earle Í99. (Gibco) tápközeg (lOx koncentrált)90 ml NaHCOj, 1,4%-os 87 ml Borjúszérum 60 ml Nátrium-benzil-penicíllin, 50 000 nemzetközi egység/ml Sterptomycin szulfát 5 ml 50 000 nemzetközi egység/ml Pimafucin (0,25%/ml) Vitaminkoncentrátum (BME, Gibco) 1 ml Glutamin, 2,6%-os 3,8 ml Két napos tenyésztési időszak után összefüggő egysejtréteg (monolayer) képződik, és a fertőzést az előző víruspasszálásból származó fertőzött sejtek szuszpenziójával végzett inokulálással hajtjuk végre. A citopatológiás hatás mértéke szerint a sejteket az egyes fertőzött tenyészetekből 4-20 friss tenyészet fertőzéséhez használjuk fel. Ebben a lépésben a fenntartó tápközeg 4 a következőket tartalmazza: Ásványmentesített víz 810 ml F-10 tápközeg (lOx) (Gibco) 50 ml Earle 199. tápközeg (10x) (Gibco) 40 ml Triptóz-foszfát tápközeg (Gibco) 40 ml NaHCOj, 1,4%-os 75 ml Boíjúszérum 30 ml Antibiotikumok stb. lásd, mint a fentebbi tápközegnél. SPF-baromfitenyészetből való 11 napos, embriót tartalmazó tojásokat alkalmazunk CEF egyrétegű tenyészetek készítéséhez. A tenyésztő tápközeg a fentebb említett tápközeggel azonos. Azokban az időszakokban, amikor a vírustörzset nem tartjuk fent DEF- ben vagy CEF-ben végzett vírusszaporítás útján, a vírust folyékony nitrogénben tároljuk -196 °C hőmérsékleten. À fertőzött sejtek fagyasztását növesztő tápközegben (lásd fentebb) végezzük, 10%-ra növelt boíjúszérummal és azonos százaléknyi mennyiségű dimetilszulfoxiddal (DMSO). A hűtési sebességet a+20 °C-tól - 40 °C-ig terjedő tartományban automatikusan szabály ózva 1 °C/perc értéken tartjuk. A csövek vírustiterének becslését CEF-ben végzett tarfoltméréssel végezzük. A csirkék intramuszkuláris inokulálását közvetlenül azután végezzük, amint a vakcinát helyreállítottuk. A fentebb leírt fenntartó tápközeg megfelel hígítónak. Minden madár 0,5 ml inokulumot kap, amely a sejttel összekapcsolt MD-vírus kívánt adagját tartalmazza. Nagy léptékű termelés. A kereskedelmi forgalomba kerülő Marek-kór vakcinát elvileg azonos módon készítjük, mint a kutatólaboratóriumban. A nagyobb léptékre tekintettel gördülő palackrendszereket alkalmazunk álló tenyésztőedények (Roux-palackok) helyett. Az inokulumanyagok ellenőrzését, az előrehaladás ellenőrzését a termelés közben, a végtermék vizsgálatát az idegen mikroorganizmusok távollétére és vírustartalomra való tekintettel azok szerint az irányelvek szerint végezzük, amelyeket szakértők nemzetközi csoportja állapított meg [Report of the Avian Products Standardization Committee of the International Association of Biological Standardization (A Nemzetközi Biológiai Szabványosítási Társaság Madár-termék Szabványosítási Bizottságának beszámolója), szerkesztették Hulse, E, C. és munkatársai 29-42. oldal, Genf, Svájc: Biostandards]. Aktivitás szempontjából a Marek-kór vakcináknak eleget kell tenniök bizonyos védő index követelményének. Ez a vakcináit és nem vakcináit csoportokban a fertőzést követően és egy' előre meghatározott időtartamon belül megbetegedett állatok százalékos arányával fejezhető ki. A víruskészítmény immunogén tulajdonságainak becsléséhez sokkal pontosabb módszer magában foglalja az 50%-os védődózis mérését (PDSÚ), amint ez a következő irodalmi helyen le van írva: Journal of Biological Standardization, 9, 15-22 (1981). Az élő, tisztított MD-vakcina jellemzői Ártalmatlanság RIR csirkékhez. Amint a fenti bevezetésben jeleztük, a CVI-988 MDV törzsön alapuló, jelenleg rendelkezésre álló 3 194496 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
