194411. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fagocitasejtek megjelölésére
1 194.411 2 A találmány szerinti módszer segítségével infekciókat lehet detektálni, jelölt fagocita sejtek alkalmazása távén. A találmány szerinti eljárásban a fenti leírás szerint készített vesiculákat vagy más jelölt micelluláris részecskéket fogacita sejteket tartalmazó oldattal kevetjük össze, majd ajelölt fagocitákat a fentiek szerint visszanyerjük. Ezután a visszanyert sejteket reszuszpendáljuk, és az emlős alanyba injiciáljuk. Néhány óra múlva az alanyt előnyösen y-sugárzás detektálására tervezett teljes-test scanerrel (pásztázó készülékkel) vizsgáljuk meg. A teljes-test leképzések, illetve a test egyes részeinek scannelésével (pásztázásával) nyert leképzések diagnosztikus célokra használhatók fel. Az infekció helyét ezután a magas sugárzási szintű területek meghatározásával lokalizáljuk. Egy másik alternatív eljárás során, amikor jelölt micellumokat juttatunk a jelölni kívánt fagocitákhoz, izotoniás, pufferolt micellum-szuszpenziót adunk be intravénásán. A vesiculák esetében ez a megközelítés nem teszi lehetővé egyensúly eltolás alkalmazását, a nem-fagocitált, felületesen kötött vesiculák disszociálása céljából, azonban a felületi kinyújtott aminok specificitása elegendő a háttér kielégítő szintre történő csökkentéséhez. Az alábbi példák a találmány részletesebb ismertetésére szolgálnak anélkül azonban, hogy korlátoznák annak oltalmi körét. 1. példa A leukociták preferenciális izotóp-felvételét úgy mutattuk ki, hogy izotóppal jelzett vesiculákat különböző vérkészítményekkel és kontroll oldatokkal inkubáltunk, amint azt az I. táblázat szemlélteti. Mindenek előtt a vesiculák készítése és feltöltése az itt hivatkozásként közölt 4.310.505, és a 4.310.506 számú USA-beli szabadalmi leírások szerint történt, 2:0, 5:0, 5:0, 004 arányban alkalmazott DSPC-vel, koleszterinnel, AMS-sel és A23187-tel. A vesiculákat szonikus kezeléssel állítottuk elő, 7,4-es pH-jú PBS-ben lévő 1 mM EDTA jelenlétében, majd 1 mCi/10 mg lipid mennyiségű In 1a -111 -gyei töltöttük fel. 10 ml, frissen levett emberi vért PBS-ben lévő 0,5 ml heparinnal (1000 NE/ml) stabilizáltunk. Mosott vörösvértesteket (RBC) frakcionált centrifugálással - 800-as g-n - állítottunk elő, 10 ml előkészített 70%-os percoll-féle sűrűségi gradiens alkalmazásával. A mosott sejteket ekvivalens mennyiségű PBS-ben szuszpendáltuk. A centrifugált teljes vér felülúszója a plazma volt. Minden egyes inkubációs keverék tartalmazott izotóppal jelzett vesiculákat - 1 mg lipidet körülbelül 0,1 ml PBS-ben - és vagy A) 2 ml PBS-t, B) 2 ml teljes vért, C) 2 ml mosott ős szuszpendált vörösvértestet, vagy D) 2 ml plazmát 37 ”C-on 30 percig tartó inkubálást követően minden vizsgálati keveréket 10 ml előkészített 70%-os Percoll-féle sűrűségi gradiensre helyeztünk és 800 g-n centrifugáltuk. A frakcionálás után azokat a kijelölt frakciókat, melyek vörösvértesteket vagy leukocitákat tartalmazhatnak - függetlenül attól, nogy ezen sejtek aktuálisan jelen voltak-e - megvizsgáltuk y-aktivitás szempontjából. Az eredményeket az I. táblázat szemlélteti. I. táblázat Vizsgálati keverék A leukocita frakció és a 5 vörösvértest frakéió radioaktivitásának aránya A) Vesiculák PBS-ben 1,6 B) vesiculák + teljes vér C) Vesiculák + mosott 30,0 10 vörösvértestek 1,2 D) Vesiculák + plazma 2,7 Az eredmények azt mutatják, hogy a Percoll-féle gradiens bizonyos torzítást hozott létre a leukoclta _ frakció (A) aktivitásában. (A várható érték 1,0, hi>5 sze,, a vesiculák eloszlásának véletlenszerűnek kell lennie, bár bizonyos diffúziós hatások lehetségesek.) A vörösvértestekkel (C) vagy plazmával (D) inkubált vesiculumok kis mértékben megváltoztatták ezt a torzítást. A vesiculákat a leukociták (B) szignifikáns 20 gyorsasággal vették fel. 2. példa A leukociták vesicula-felvételét láthatjuk kutyavér- 25 ben. Nemcsak az inkorporált radioaktivitás szintje, hanem a jelölési hatékonyság is magas. Az izotóppal jelzett vesiculákat az 1. példa szerint készítettük. Frissen levett és heparinozott kutyavőrt (2 ml-es minták) 60 percig 37 °C-on inkubáltunk kis mennyiségű, 10-250 pg lipidnek megfelelő vesiculá- 30 val. Ezután a keveréket centrifugáltuk, és szétválasztottuk az üledékben lévő, sejtekhez kötött vesiculákat a plazmában lévő, nem kötött vesiculáktól, amit kidobtunk. Friss plazmával reszuszpendált sejteket adtunk pipetta segítségével 1 g USP vattával megtöl__ tött, 5 cnr-es fecskendőkhöz. 30 ml PBS-sel történő átmosáskor a fagocita leukociták megkötődnek, míg a vörösvértestek (RBC) leoldódnak az oszlopról. Minden egyes frakció ^-aktivitását meghatároztuk. Az eredményeket a II. táblázat szemlélteti. II. táblázat Teljes vérhez (2 ml) hozzáadott vesicula mennyiség (g) Leukocita aktivitás és vörösvértest aktivitás aránya A fagocita leukocitákkal -kapcsolatos összaktivitás ' %-a A) 250 38 39 B) 100 33 65 C) 50 67 68 D) 10 26 43 Kétségtelen, hogy mind( a preferenciális jelölés, mind pedig a magas abszolút jelölési szint lehetséges a leukociták esetében. Meg kell jegyezni, hogy a (C) feltétel 1 mg lipid vesicula ekvivalensét jelenti, amit cc 40 ml vér jelölésére használunk. Ezt a térfogatot al° kalmazzuk jelenleg az In-oxin jelölési eljárásban. Jellegzetes módon, 1—2 mCi In-lll-et használunk y-leképzésre. A vesiculák feltöltését 1 mCi/mg lipid specifikus aktivitással értük el. Ez megfelelően biztosiba izotóppal jelzett vesiculákat tartalmazó leukociták 50 felhasználását fertőzéses gócok leképzésére. 5
