194318. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta 1-dehidrogénezésére toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyagok jelentlétében
\ 1 dós rizón inkubáljuk. Szabályos Időközökben mintát veszünk, metflén-kloriddal extraháljuk és a bio konverzió szempontjából analizáljuk. Eredmények: Lombik Szuperoxid-Képződött tennék diszmutáz mennyisége (mg/lombik) 22 óra 7Ö óra 1 0,0 mg 0,37 g 0,68 g 2 0,3 mg 7. példa 0,41g 0,81g Reakdóelegybe az alábbi anyagokat mérjük: a) 0,681 50 mmól/l-es kálium-foszfát puffer (pH 7,5) b) 6,4 g szántott A. simplex sejt c) 0,32 g menadion d) 13 mg marhamáj-kataláz (2000 nemzetközi egység/mg) e) 32g androszt4,9(ll)-dién-3,l 7-dion 0 0,3201 toluol. A reakdóelegyet 15 cal/1 x perc-cel keverjük. A reakdóelegybe vezetett levegővel a reaktor a légterében 3% feletti oxigénkoncentrádót biztosítunk. A hőmérsékletet 28 ± l°C-on tartjuk. A reakdót 47 órán keresztül hagyjuk végbemenni, majd a toluolos fázist elválasztjuk. Jelen esetben a toluolos fázis szterold összetétele az alábbi: 99,9% termék (androszt-l,4,9(l l)-trién-3,17- -dion) 0,1% átalakulatlan szubsztrát (androszt-4,9- -(1 l)-dién-3,l 7-dion). 8. példa 3 rázólombikba az alábbi anyagokat, mérjük: a) 23 ml 50 mmól/l-es kálium-foszfát-puffer (pH 7,5) b) 0,04 g száraz A. simplex sejt c) 0,25 ml 50 mmól/1 menadion 3A-alkoholban. Az egyes lomblkokat az alábbi anyagokkal egészítjük ki: 1. lombik: semmi 2. lombik: 0,167 mg kataláz (2000 nemzetközi egység/mg) 3. lombik: 2 mg 5% fémtartalmú szénhordozós platinakatalizátor. Minden egyes lombikba bemérünk 0,2 g androszt-4,9(11 )-dién-3,17-diont és 2 ml toluolt. A lombibikokat szobahőmérsékleten 3 napon át rázatjuk. 3 napos inkubálás után minden lombikba 23 ml toluolt mérünk. Az extraktumot analizáljuk. Eredmények: 1. lombik 2. lombik 3. lombik kontroll katalázzal platinával Termék (androszt•1,4,9(11)-trién-3,17--dion) 80,8%, 99,9% 95,9% Szubsztrát (androszt- 4,9(11)-dién-3,17- -dion) 19,2% 0,1% 4,1% 2 9. példa Az Arthrobacter simplex sejteket 20 g/1 kukoricalekvárt és 15 g/1 disznózsír-olajat tartalmazó táptalajon (pH 7,0) tenyésztjük. A tenyészetet 28°C-on kb. 26 órán át inkubáljuk, majd hozzáadunk 0,15 g/1 kortizon-acetátot. Az inkubálást 18 órán át folytatjuk. A sejteket centrifugálással elválasztjuk a táptalajtól. A kapott sejteket a fermentlé felé térfogatának megfelelő mennyiségű 0,05 mól/l es kálium-foszfát-pufferban (pH 7,5) újraszuszpendáljuk. A lombikokba száraz por formájában 10 g/1 androszt-4,9(l 1)-dién-3,20-diont adunk. Az (A) lombikba nem adunk más anyagot. A (B) lombikban lévő szteroidhoz 8,6 mg menadiont és 1600 egység katalázt mérünk. 5 órás inkubálás után az (A) lombikban közel 5% I, 2-dehidrogénezett tennék képződik. A (B) lombikban lévő szteroid 95%-ban 1,2-dehidrogénezett termékből és kb. 5%-ban átalakulatlan szubsztrátból áll. Az inkubálást tovább folytatva az (A) lombikban kb. 10% dehidro-terméket és kimutatható mennyiségű nemkívánatos bomlásterméket találunk a reakcióelegyben. A (B) lombikban a további inkubálás hatására ugyan nem képződik több termék, de nem találunk kimutatható mennyiségű bomlásterméket sem. 10. példa A 3. példában a hidrokortizont, az 1., 7. vagy 9. példában az androszt-4,9(ll)-dién-3,l7-diont és a 6. példában a 16/3-meÜl-A4,9(1 l)-androsztén-diont az alább felsorolt szubsztrátokkal helyettesítve az alábbi termékeket kapjuk: Szubsztrátok: 1. androszt-4-én-3,l 7-dion 2. 6a-fluor-androszt-4,9( 11 )-dlén-3,17 -dión 3. 6a-metil-androszt4,9(l l)-dién-3,l 7-dion 4. 16/?-metil-androszt-4,9(l l)-dién-3,l 7-dion 5. 17a-hidroxi-pregn-4-én-20-in-3-on 6. 17a-hidroxi-pregn4,9( 11 )-dién -20-in-3 -on 7. 17a-lüdroxi-16/3-metil -pregn-4,9( 1 l)-dién-20- -in-3-on 8. 1 l/321-dihidroxi-pregn4,l 7(20)-dién-3-on 9. 21-acetoxi-l l/3-hidroxi-pregn4,17(20)-dién-3- -on 10. 6a-metil-l l/321-dihidroxi-pregn4,17(20)-dién-3-on II. 20-klór-pregn4,9(l l),17(20)-trién-21-al-3-on 12. hidrokortizon 13. 6a-metil-hidrokortizon 14. 21-acetoxi-l l/3,17-dihidroxi-16/3-metil-pregn4- -én-3,20-dion 15. 21-acetoxi-9a-fluor-l l/3,17-dihidroxi-16/?-metil-pregn4-én-3,20-dion 16. 21-acetoxi-9/J,l l/3-epoxi-17-hldroxi-16/3-metil-pregn4-én-3,20-dion 17. 21 -acetoxi-17-hidroxi-pregn4,9( 11 >dién-3 ,20- -dion 18. 21 -acetoxi-16a,17-dihidroxi-pregn4,9(l l>dién-3,20-dion 19. 21 -acetoxi-17-dihldroxi-16o-metíl-pregn4,9 - -(1 l)-dién-3,20-dion 20. 21 -benzol! oxi-17-hidroxi-16/3-metíl-pregn4,9 (1 l>dién-3,20-dion 21. 21 -acetoxi-17-hidroxl-l 6/3-metil-pregn4,9( 11> •dién-3,20-dion 194 318 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
