194318. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta 1-dehidrogénezésére toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyagok jelentlétében
\ 1 metanolban, acetonban vagy egyéb hasonló oldószerben - oldva vagy szuszpendâlvç adagolhatjuk a rendszerbe, mennyisége a végtérfogatnak legfeljebb 5%-a lehet. Kis koncentrációban - például 0,5-5%-ban - felületaktív szereket is adhatunk a szteroid szuszpenzióban tartásához. Az elektron-hordozót — például menadiont, 1,4-naftoldnont, fenazin-metoszulfátot - por, vizes sűrű szuszpenzió formájában, vagy vízzel elegyedő szerves oldószerben oldva adagolhatjuk a reakcióelegybe. A toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyagokat előnyösen a reakció kezdetén adagoljuk az elegybe. Az eljárással elérhető előnyök jelentős mértékben függenek az alkalmazott enzimkészítmény típusától, a szubsztrát/sejt aránytól (előnyösen 2:1, vagy annál nagyobb), és/vagy a katalizátorként használt elektron-hordozó koncentrációjától. Biokonverzió vízzel nem elegyedő oldószer jelenlétében A vizes szteroid-l-dehidrogenáz aktivitással rendelkező elegyhez a szteroid-szubsztrát, elektron-hordozó és a toxikus oxigén féleségektől mentesítő anyag mellett vízzel nem elegyedő oldószert is adhatunk. Az oldószert olyan mennyiségben adjuk az elegyhez, amely részben vagy egészen elegendő a szteroid-szubsztrát és a tennék oldásához. A fenti módosítást a fermentációs biokonverziós rendszerben alkalmazhatjuk, ahol az átalakítást izolált nedves sejttel, száraz sejttel, sejtmentes enzimmel vagy immobilizált enzimmel végezzük. A vízzel nem elegyedő oldószer jelenlétében végzett biokonverzió reakciósebessége nagy mértékben függ a keverés intenzitásától, ezért a reakcióelegyet a lehető legintenzívebben kell keverni. Az átalakulatlan szubsztrátot és a biokonverzió termékét a fenti reakcióelegyből hagyományos eszközökkel nyerhetjük ki. A szteroidokat jellegzetes módon szűréssel, majd a szűrőn maradt csapadék szerves oldószeres - például acetonos vagy metilén-kloridot - extrahálásával választhatjuk el a reakcióelegyből. Úgy is eljárhatunk, hogy a teljes reakcióelegyet extraháljuk valamely vízzel nem elegyedő oldószerrel, például butil-acetáttal vagy metilénkloriddal. A terméket ezután elválasztjuk a szerves oldószertől. Az 1,2-dehidro-szteroidok felhasználási területe jól ismert. Például a 3 284 447. számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásban ismertetett aM,9(1 l)_pregnatriének a 16-helyzetben helyettesített diuretikus hatású kortikoszteroidok szintézisében hasznosíthatók. A 4 041 055. számú Amerikai Egyesült ÁDamok-beli szabadalmi leírás eljárást ismertet a kortikoszteroidok előállítására A*A -androszténdionból és ismertet más jelentős köztitermékeket is a gyógyászatilag alkalmazható szteroidok előállítására. A találmány szerinti eljárást részleteiben - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni. A. példa Androszt-4,9(11 )-dién-3,l 7-dion fermentációs biokonverzió/a A. simplex-szel a) Biokatalizátor előállítása Az Arthrobacter simplex (ATCC 6946) tenyésztésére 20 g/1 kukoricalekvárt és 15 g/1 disznózsír-olajat tartalmazó táptalajt (pH 7,)) használunk. A tenyé2 szetet rotációs rázón 2 napon át 28°C-on inkubáljuk, majd hozzáadunk 0,15 g/1 kortizon-acetátot a szteroid-l-dehidrogenáz aktivitás indukálására. b) Biokonverzió A következő napon különböző koncentrációkban androszt-4,9(1 l>dién-3,17-diont adunk a lombikba. Meghatározott lombikokba menadiont és/vagy katalázt adagolunk. A biokonverziót a metilén-klorídos extraktumok vékonyréteg-kromatográfiás elemzésével követjük. Azokban a reakcióelegyekben, amelyek 3,5 g/1 koncentrációban csak szteroidot tartalmaznak, az 1-dehidrogénezés csak kis mértékben játszódik le. Egy napos ínkubálás után a szubsztrátnak kb. 10%-a dákul kívánt 1,2-dehidrogénezett termékké és kb. 5%-a egyéb termékké. A negyedik napra az 1,2-dehidro-terméknek 5%-nál kisebb része marad meg, míg a szteroid 10-20%-a három vagy még több fajta nemkívánatos poláros szteroid-termékként jelenik meg. Azok a biokonverziós elegyek, amelyek 3,5 g/1 szteroid-szubsztrátot és 5 x ÍO'4 mól/1 menadiont tartalmaznak, az összes jelenlévő szteroid közel 50%-át 1-dehidrogénezett termékként tartalmazzák. Azonban a reakció nem megy végbe teljesen további Ínkubálás hatására sem, és a szteroidok degradálódása figyelhető meg, noha kisebb mértékben. Azokban a biokonverziós elegyekben, amelyek 10 mg/1 katalázt (Sigma termék Cl-0, 16 000 egység/ 1-rel egyenértékű), 5 x 10'4 mól/1 menadiont és 10 g/1 szubsztrátot tartalmaznak, a konverzió sikeres. A konverzió 22 órán belül 83%-ban végbemegy, és 46 óra múlva 95%-os. A reakcióelegyben vékonyréteg-kromatográfiás meghatározás szerint nem találunk jelentős mennyiségű bomlásterméket. A katalázt és szteroidot tartalmazó kontroll mintában a fermentléből és szteroidból álló mintával kapott konverzióhoz hasonló átalakulás érhető el. 2. példa llfi-hidroxi-androszténdion (llßOH-AD) fermentációs biokonverziója A. simplex-szel a) Biokatalizátor előállítása Az Arthrobacter simplex-et (ATCC 6946) rázott lombikban tenyésztjük, 6 g/1 glükózt, 6 g/1 kukoricalekvárt és 6 g/1 Bactopeptont (Difco) tartalmazó táptalajban, pH 7,0 értéken. A tenyészetet rotációs rázón 28°C-on inkubáljuk, míg a glükóz elfogy. Ekkor 0,1 g/1 kortizon-acetátot adunk a tenyészethez a szteroid-l-dehidrogenáz aktivitás indukálására. -b) Biokonverzió Egy éjszakán át tartó Ínkubálás után minden egyes lombikba 10 g/1 1 l/JOH-AD-t mérünk. A kontroll lombikba nem adunk más anyagot. A kísérleti lombikba 5 x ÍO^4 mól/1 menadiont és 10 mg/1 katalázt (Sigma termék C-10,16 000 egység/l-nek felel meg) adunk. A biokonverziós elegyet rotációs rázón 286C-on inkubáljuk. A konverzió követésére adott térfogatú mintát két térfogatnyi metflén-kloriddal extrahálunk, és az extraktumot vékonyréteg kromatografáljuk 1 : 1 arányú etil-acetát-heptán eleggyel. A konverzió előrehaladtát megfelelő szteroid-standardokkal végzett összehasonlítás alap-Íán becsüljük meg. iredmények: Lombik Biokon- Átalaku- Megjegyzés verzió latlan ideje szubsztrát (óra) (%) 194 318 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
