194318. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta 1-dehidrogénezésére toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyagok jelentlétében
1 194318 2 Az 1 -dehidrogénezésl célra leggyakrabban használt mikroorganizmusok az Arthrobacter simplex ATCC 6946, amely a 2 837 464. számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásból tómért. A továbbiakban túlnyomóan ezt a mikroorganizmust használjuk a találmány szerinti eljárás közelebbi ismertetése céljából. Természetesen a találmány szerinti eljárás bármely, a szteroldok biológiai átalakítására használt mikrobiológiai eredetű 1-dehidrogenáz-készítménnyel lefolytatható, beadagolt elektron-hordozók és a képződő toxikus oxigénféleségek inaktiválására alkalmas anyagok jelenlétében. A szteroid-dehidrogenáz biokatalizátor előállítása A mikroorganizmusok tenyésztésére használt vizes táptalaj az alábbi összetevőket tartalmazza: a) a mikroorganizmus szaporodásához szükséges nitrogén-forrásként szervetlen sókat - például nitrát-, vagy ammónium-sókat — vagy szerves nitrogénvegyületeket, például élesztő-kivonatot, peptont, kukoricalekvárt, b) szén- és energiaforrásként szénhidrátokat és cukorszármazékokat, olajat, zsírsavakat és zsírsavmetil-észtereket, alkoholokat, aminosavakat és szerves savakat, c) ionokat. és nyomelemeket — például nátrium-, kálium-, magnézium-, foszfát-, szulfát-, mangánréz-, kobalt-, molibdén-lonokat - a csapvízben vagy a kevéssé tisztított táptalaj-alkotórészekben - például kukoricalekvárban — előforduló mennyiségben. A mikroorganizmus szaporodásához oxigént igényel. A hőmérséklet 10 és 45°C között változhat, az optimum 28 és 37°C között van, A. simplex esetén. Az A. simplex szaporodásához optimálisan semleges pH körüli értéket biztosítunk. A sejtek szteroid-1- dehidrogenáz aktivitásának indukálására legalább 0,005 vegyes%-ban egy 1,2-telített 3-keto-szteroidszármazékot - például androszta-4-én-3,17-diont vagy kortizon-acetátot — adunk a tenyészethez. Az indukálószert a tenyésztési ciklus tetszőleges pontján hozzáadhatjuk a tenyészethez. A nutrienseken - például disznózsír-olajon — tenyésztett mikroorganizmusok rendszerint gyorsan elkezdik a szteroid-l-dehidrogenáz szintetizálását, míg a glükózon tenyésztett mikroorganizmusoknak az enzim-szintézis megindulása előtt el kell fogyasztaniuk a glükózt. Az Induktor hozzáadása után célszerűen legalább 6 órán át inkubáljuk a tenyészetet. Ezután az 1,2- -dehidrogenáz aktivitással rendelkező tenyészetet tetszőleges formában felhasználhatjuk a kívánt szteroid-szubsztrát 1-dehidrogénezéséneic katallzálására. A teljes sejteket tartalmazó fermentlevet közvetlenül is felhasználhatjuk. Ugyanezeket a sejteket felhasználhatjuk úgy is, hogy először a táptalajból a szokásos módon - például centrifugálással, flokkulálással és szűréssel vagy ultraszűréssel - összegyűjtük és koncentráljuk azokat. Az elválasztott sejteket vagy nedves állapotban — körülbelül 60-80% nedvességtartalmú formában - használjuk fel, vagy szárítás után. A szárítást például rövidszénláncú alkanollal vagy alkanonnal, így -acetonnal végzett kezeléssel, vákuum-szárítással melegítés közben, fagyasztva szárítással, levegős szárítással melegítés közben, vagy porlasztásos szárítással végezzük, míg a nedvességtartalom 3-30%-ra csökken. A nedvességtartalom előnyösen 1-10%. A sejteket a felhasználásig előnyösen 5°C-on tároljuk. Aktív száraz sejteket úgy is előállíthatunk, hogy a száraz sejteket a szokásos eljárással immobilizáljuk, például a sejteket poll(akrll-amid>gélbe vagy kollagénbe zárjuk, vagy polielektro- Ht-hordozóhoz kötjük kovalens kötéssel, a (Methods in Enzimology, XLIV. kötet, 11-317. oldai (1976) Academic Press, Inc., New York] irodalmi helyen leírtak szerint. A peroxid-mentesitő anyagok hozzáadásával megszüntethetjük a különböző módszerekkel koncentrált és szárított sejtek szteroid-l-dihidrogenáz aktivitásában a különféle biokonverziós eljárások során észlelhető eltéréseket. A szteroid-l-dehidrogenáz aktivitás sejtmentes formában, oldatként vagy immobilizált enzimként is hasonló eredménnyel használható a szteroidok 1-dehidrogénezésének katalizálására. Az aktív enzimet a mikroorganizmus-sejtekből a szokásos feltárási eljárásokkal - például ultrahangos kezeléssel, vagy nyomással végzett roncsolással, a [Manual of Methods for General Bacteriology 367. oldal (1981) American Society for Microbiology, Washington, D. C.] irodalmi helyen leírtak szerint, vagy más ismert módon - tehetjük szabaddá. A szabaddá vált enzimet nyers extralktum formájában is használhatjuk, de a szokásos biokémiai fehénetisztítási eljárásokkal tovább is tisztíthatjuk, például a [Methods in Enzymology, XXII. kötet, (1971), Academic Press, Inc., New York] irodalmi helyen ismertetett módszerek szerint. A tisztítást például centrifugálás, ammónium-szulfátos kicsapás, gélszűrés, ioncserélő kromatográfla, izoelektromos módszerek és hasonló műveletek kombinálásával hajtjuk végre. Biokonverzió A biológiai átalakítás során a szteroid-l-dehidrogenáz aktivitású készítményt szteroid-szubsztráttal Hozzuk össze, hozzáadott elektron-hordozó és egy vagy több toxikus oxigénféleségektől mentesítő anyag, például peroxid-mentesitő anyag, vagy szuperoidd-diszmutáz és peroxid-mentesitő anyag jelenlétében. A biológiai átalakítást vizes rendszerben, vagy 0%-nál több, de 100%-nál kevesebb vízzel nem elegyedő szerves oldószert - például toluolt, xilolt, benzolt, heptánt, butil-acetátot, metilén-kloridot vagy más hasonló oldószert - tartalmazó vegyes rendszerben végezzük. Az elektron-hordozót azért adjuk a rendszerhez, hogy elősegítsük a szteroid-l-dehidrogénezést és/vagy gátoljuk azokban a készítményekben a szteroid-bontó aktivitást, amely készítményekben ezt az aktivitást előzőleg nem szüntettük meg. Külső elektron-hordozóként például menadiont (2-metil-l,4-naftokinon), menadion-biszulfitot, 1,4- -naftokinont, fenazin-metoszulfátot, fenazin-etoszulfátot, K-vitamin-csoportba tartozó anyagokat, vagy hasonló vegyületeket használunk. Az elektronhordozót előnyösen katalitikus mennyiségben — például 2,5 x 10'4 mól/1 és 5,0 x 10's mól/1 közötti koncentráció-tartományban - adjuk a rendszerhez az 1-dehidrogénezési reakció elősegítésére. A toxikus oxigén-féleségektől mentesítő anyagok hozzáadásának előnyös hatása különösen akkor tapasztalható, ha növeljük a hozzáadott elektron-hordozó mennyiségét. A fenti hatás abban nyilvánul meg, hogy adott mennyiségű szteroid átalakításához kevesebb szterold-l-dehidrogenázt kell alkalmaznunk, a reakciósebesség fokozódik, kevesebb az átalakulatlan anyag, magasabb szubsztrát-koncentráció alkalmazható, stb. Ha az oxigénféleségektől mentesítő anyagot elhagyjuk, a nagyobb koncentrációban használt clektron-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
