194317. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A40926 antibiotikum komplex és tiszta komponensei, a PA,PB,A,B,BO faktor, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

1

194 317

2

oldatot felviitzük az előbbiekben ismertetett affinitás-oszlopra, ezt desztillált vízzel mossuk és egy illékony vizet bázissal eluálunk, amint ezt az affinitáskromatográfiával kapcsolatos elució esetében az előbbiekben leírtuk. Az így kapott termék az A 40926 antibiotikum komplex. Ezt szükség esetén tovább vagy megosztásnak vethetjük alá az A, PB faktor előállítására, eljárást jelent a tiszta A 40926 antibiotikum komplex előállítására az előbbi módon kapott komplex további tisztítása egy affinitáskromatográfiás oszlopon. Általában az előbb említett stacionárius fázist (D-alanil-D-alanin) alkalmazzuk és a keresett antibiotikumot úgy eluáljuk, hogy az előbbiekben ismertetett, rögzített D-alaníl-D-alanin felhasználásán alapuló-affinitáskromatográfiás eljárást követjük. Kitüntetett rögzített D-alanil-D-alanin a Sepharose-epszilon-aminokaproil-D-alanil-D-alanin, előnyben részesítjük kiegyensúlyozó elegyként a pH 7-8-ra beállított, 2 M NaCl-ot tartalmazó 0,16%-os (tömeg/' térf.) ammóniát. Előnyben részesítjük továbbá a következő oldatok alkalmazását: átöblítő oldatként pH 8-9,5-re beállított 2 M NaCl-ot tartalmazó 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia-oldat; eluáló elegyként pH 10,5—12-re beállított, 2 M NaCl-ot tartalmazó 0,16%-os (tömeg/térf.) ammónia, mimelleh a leginkább kitüntetett eluáló elegy az előbbi összetételű oldat, pH 11,5-re beállítva.

Az A 40926 antibiotikum faktorokat - nevezetesen az A 40926 antibiotikum A faktort, az A 40926 antibiotikum B faktort, az A 40926 antibiotikum B0 faktort, az A 40926 antibiotikum PA faktort es az A 40926 antibiotikum PB faktort — az A 40926 antibiotikum komplex vizes oldatából különítjük el oszlopkromatográfiával, előnyösen fordított fázisú oszlopkromatográfiával. A fordított fázisú oszlopkromatográfia esetében a kitüntetett stacionárius fázis a szilanizált szilikagél. Jó eredményeket kapunk azonban abban az esetben is, ha az oszlopkromatográfiát eredeti (funkcionálisan nem átalakított) polisztirol és akrilsav gyantákon hajtjuk végre. A kereskedelemben ezek a következő neveken szerezhetők be: Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7, és XAD-8) Rohm és Haas) vagy Diaion HP 20 (Mitsubishi).

Abban az esetben, ha a fordított fázisú tisztítási lépést stacionárius fázisként szilanizált szilikagélen hajtjuk végre, az oszlopot előzetesen — egy előnyös megoldás szerint - egy pH 4-9 közötti vizes pufferoldattal, előnyösen pH 5,5—6,5 puffer-oldattal hozzuk egyensúlyba, majd egy poláris, vízzel elegyedő oldószerrel (ugyanezzel a pufferoldattal képzett lineáris grádienselegyével) eluáljuk. Jellemző példák a poláris, vízzel elegyedő oldószerekre: vízben oldható alkoholok (pl. metanol, etanol, izopropanol, n-butanol), aceton, acetonitril, tetrahidrofurán, dioxán és dimetilformamid, illetőleg ezek elegyei. A kitüntetett poláris, vízzel elegyedő oldószer az acetonitril.

Az eluált frakciók antibiotikum tartalmát a szokásos biológiai vizsgálatok segítségével — amilyen a pa-. pírkorong vagy az agardiffuziós vizsgálat - határozzuk meg, valamely érzékeny mikroorganizmussal. Az érzékeny mikroorganizmusok közé tartozik a Bacillus subtilis és a Streptococcus aureus.

A kromatográfia előnyösen követhető TLC vagy HPLC technikákkal is.

Előnyben részesített HPLC technika pl. egy fortisztíthatjuk B, Bn, PÂ és Célszerű

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

dftott fázisú HPLC eljárás, amelynek során a következő elemeket alkalmazzuk: porózus, gömbalakú - átmérő előnyösen 5 /ion átmérőjű -, C-18 alkil-csoportokkal funkcionalizált, szilanizált szilikagél részecskéket tartalmazó oszlop (ilyen töltet pl. az 5 fim Ultraspherevty ODS Altex, Beckman Co.), C-18 alkilcsoportokkal funkcionalizált szilikagéit tartalmazó előoszlop (ilyen töltet pí. az RP 18, Brownies Labs), és egy olyan eluálószer, amely egy poláris, vízzel elegyedő oldószer (pl. valamelyik előbbiekben említett oldószer (lineáris grádians elegye valamely vizes puffer-oldattal.

Ezt az oldatot előnyösen pH 5-7-re állítjuk be. Különösen kitüntetett eluálószer egy olyan oldat, amely 5-60% B eluálószert - lineáris grádiens eloszlásban - tartalmaz A eluálószerben. Ebben az esetben az A eluálószer pH 5-7-jú 10 : 90 acetönitril : vizes puffer elegy, és a B eluálószer pH 5-7-jú 70 : 30 acetonitril : vizes puffer elegy. Mint ez a szakember számára ismert, belső standardként számos, anyag használható.- Nagyon előnyös esetünkben a teikoplanin A2, 2. komponens (Gruppe Lepetit

S. p. A.) alkalmazása, amelynek retenciós ideje ebben a HPLC rendszerben közel áll a találmány szerinti vegyületekéihez. Ezt a standard anyagot a 2121401 sz. brit szabadalmi bejelentés ismerteti és jellemzi.

A hasonló antibiotikus aktivitást mutató frakciókat összeöntjük és az előbbiekben leírt módon sómentesítjük. így lényegében tiszta A 40926 antibiotikumot A, B, Bf), PA és PB faktorhoz juthatunk.

A lényegében tiszta A 40926 antibiotikum A faktort, A 40926 antibiotikum B faktort, A 40926 antibiotikum Bq faktort, A 40926 antibiotikum PA faktort és a 40926 antibiotikum PB faktort az ezeket tartalmazó frakciókból számos ismert eljárással nyerhet-, jük ki, amilyen pl. a liofilizálás, kicsapás kicsapószerekkel vagy kicsapás a pH változtatásával, a vizes oldatban.

Egy kitüntetett eljárás abból áll, hogy olyan oldószert adagolunk, amely képes vízzel azeotróp elegyeket képezni, azeotróp desztillációval eltávolítjuk a vizet, majd egy - pl. az előbbiekben ismertetett - kicsapószert adunk a maradékhoz és a képződött csapadékot szűréssel összegyűjtük.

Legalábbis bizonyos fermentációs körülmények között az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor az A 40926-ot termelő mikroorganizmus két fő antibiotikum terméke. Az A 40926 antibiotikum A és B faktor főként az A 40926 antibiotikum PA, illetőleg PB faktor átalakulási terméke és gyakran már jelen van a fermentlében.

Ténylegesen azt találtuk, hogy az A 40926 antibiotikum PA faktor átalakítható az A 40926 antibiotikum A faktorrá, az A 40926 antibiotikum PB faktor pedig A 40926 antibiotikum B faktorrá, bázisos kö-. rülmények alkalmazásával. Az A 40926 antibiotikum PA faktor és az A 40926 antibiotikum PB faktor pl. A 40926 antibiotikum A faktorrá, illetőleg B faktorrá alakítható át 0,5-10^os vizes ammóniával vagy más nukleofil bázissal - pl. egy szerves aminnal — szobahőmérsékleten, 8-24 órán át végzett kezeléssel.

Következésképp: ha egy fermentlevet, vagy egy A 40926 antibiotikumot vagy ennek koncentrátumát tartalmazó kivonatot bizonyos ideig bázisos körülmények között állni hagyunk (pl. egy nukleofil bázis vizes oldata hozzáadása után, pH 9 fölött, egy éjszakán át), olyan A 40926 antibiotikum komp-5