194317. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A40926 antibiotikum komplex és tiszta komponensei, a PA,PB,A,B,BO faktor, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 317 2 6. példa Alternatív eljárás az A 40926 antibiotikum B faktor elkülönítésére A 2. A és B. példa szerinti eljárás utolsó lépésben nyert koncentrátumokat szűrjük és a szürletet felvisszük egy szllanizált szflikagél oszlopra (400 g, töltet-magasság 30 cm, részecskeméret 0,20—0,07 szitalyukbőségnek megfelelő, Merck Inc.), amelyet előzetesen vízzel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 6 liter vízzel öblítjük át és az adszorbeálódott antibiotikum acetonítrll : víz eleggyel oldjuk le a következő séma szerint: 2,7 liter 5% (térf./térf.) acetonítrll vízben 1,6 liter 10% ,, „ „ 2,97 liter 15% 3,15 liter 20% „ „ „ Kb. 18 ml-es frakciókat szedünk. Az eluált frakciók aktivitását papírkorongos biológiai vizsgálattal határozzuk meg - érzékeny mikroorganizmusokkal, pl. Bac. subtiHs-szel — és HPCL- vel elemezzük ezeket. A hasonló antibiotikum tartalmú frakciókat összeöntjük (472.-526. frakció) és csökkentett nyomáson betöményítjük. Ehhez a koncentrátumhoz n-butanolt adunk a víz azeotrópos eltávolítása érdekében. A visszamaradó butanolos oldatot ezután Ids térfogatra töményítjük be, az A 40926 antibiotikum B faktor kicsapására (1,4 g). Ezt a terméket petroléterrel mossuk, kevertetés közben és szűréssel összegyfljtük (háromszor). Vákuumban való szárítással 760 mg A 40926 antibiotikum B faktort kapunk. Az A 40926 antibiotikum B faktort az előbbi oszlopkromatográflás kezelésnek vetjük alá. így 540 mg A 40926 antibiotikum Bq faktort kapunk, amelynek fizikokémiai jellemzői azonosak az előbbiekben az A 40926 antibiotikum B faktorral kapcsolatban megadottakkal, azzal a különbséggel, hogy a HPLC elemzés során csak 1 csúcsot mutat, nevezetesen azt a csúcsot, amelyhez 1,22 retenciós idő tartozik, a teikoplanin A2 2. komponenséhez viszonyítva. 7. példa Az A 40926 antibiotikum PA faktor és az A 40926 antibiotikum PB faktor átalakítása A 40926 antibiotikum A faktorrá, illetőleg B faktorrá 50 mg A 40926 antibiotikum PA faktort és 50 mg A 40926 antibiotikum PB faktort külön-külön feloldunk 2,5 ml 1%-os (tömeg/térf.) vizes ammóniumhidroxidban és a kapott oldatokat kb. 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, kevertetés mellett. A vizet n-butanollal végzett azeotróp desztillációval eltávolítjuk, majd a terméket etiléterrel kicsapjuk és a csapadékot szűréssel összegyűjtük (kitermelés kb. 75%). Az eredetileg az A 40926 antibiotikum PA faktort tartalmazó oldatból kapjuk az A 40926 antibiotikum A faktort és az eredetileg az A 40926 antibiotikum PB faktort tartalmazó oldatból az A 40926 antibiotikum B faktort. A D-ah-D-ala-Sepharose előállítása 1 g aktivált CH-Sepharose 4B-t (Pharmacia Fine Chemicals) 15 percen át jéghideg 1 mM sósavban duzzasztunk és ugyanezzel az oldattal mosunk. A kapott gélt (kb. 3 ml) 30 mg D-alanll-D-alanil 0,5 M nátriumklorid 0,1 M nátriumhidrogénkarbonát pufferrel (pH 8) elkészített oldatában szuszpendál-5 10 15 20 juk. A keveréket 1 órán át szobahőmérsékleten síkrázógépen rázatjuk. A kapcsolási reakció befejeződése után a ligandum feleslegét a puffer-oldattal kimossuk. A dextrán hordozó meg nem kötött aktivált csoportjait oly módon blokkoljuk, hogy pH 9-en 1 órán át 1 M etanolamin-hidroldoridda] kezeljük az elegyet'. Ezután a Sephadex-epazllon-amlnokaprofl-D-alanfl-D-alanin módosított mátrixot szűréssel kinyerjük és a- iposan mossuk, felváltva, pH 4 0,5 M nátriumklorid-0,1 M nátriumacetát pufferrel, illetőleg 0,5 M nátriumklorid-0,1 M trisz(hidroximetil)-aminometán (pH 8) pufferrel (négyszer). 8. példa Sóképzés Az A 40926 antibiotikum A, PA, B és PB faktorának Na-sóvá, illetve HCl-as sóvá történő átalakítását ismert módon NaOH-dal, illetve sósavval végeztük. A sók 180°C fölötti hőmérsékleten bomlanak. Az alábbi táblázat tartalmazza a sók elemanalízise során nyert értékeket és a 140°C hőmérsékletre való melegítés esetén mért tömegcsökkenést. 1 25 30 35 40 45 50 55 60 C% H% N% Cl% Na% tömegcsökke_______________________________________nés% A faktor Na-só PA faktor 50.71 5.05 5.80 3.60 1.20 10.20 Na-só B faktor 49.05 5.02 5.47 3.45 1.13 13.30 Na-só PB faktor 51.20 5.21 5.65 3.44 3.75 9.80 Na-só A faktor 49.51 5.06 5.45 3.46 3.36 12.80 .HQ B faktor 47.65 5.86 5.41 5.12 — 15.40 .HQ 47.70 5.68 5.40 5.18 — 15.00 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás A 40926 antibiotikum komplex, az A 40926 antibiotikum A faktor, az A 40926 antibiotikum B faktor, az A 40926 antibiotikum B« faktor, az A 40926 antibiotikum PA faktor, az A 40926 antibiotikum PB faktor, valamint ezek keverékei és addiciós sói előállítására, amelyek a következő tulajdonságokkal rendelkeznek: A 40926 antibiotikum A faktor szabad alakban: A)UV abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximumokat mutatja: lamb da (nm) a) 0,1 N HQ i8f b) pH 7,38 foszfát puffer c) 0,1 N nátrium- vagy kálium-281 300 (váll) hldroxid 300 d) metanol 282 e) pH 9,0 foszfát puffer 282 300 (váll) B) IR abszorpciós spektrum, amely a következő abszorpciós maximuokat mutatja (cm’1 ): 3700-3100 , 3100-2800 (nujol), 1655, 1620- 1560, 1480-1410 (nujol), 1375 (nujol), 1320-14
