194315. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új szénhidráttartalmú antibiotikumok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 315 2 fordulattal keverve és percenként a fennentlé térfogatára számított 0,35 térfogat levegővel levegőztetve inkubáljuk. Szükség esetén a fennentlé pH-ját híg sav vagy alkáli-hidroxi hozzáadásával 6,8 és 7,5 között tartjuk. A nonnális fermentálásban a pH értéke általában 7,5-ig emelkedik, majd a fermentálás végén semlegesre csökken. Az AT 2433 antibiotikum tennelését a tenyészet Micrococcus luteus ATCC 9341 vagy Staphylococcus aureus 209 P törzsekkel szemben neomicin meghatározására szolgáló agarban (BBL) mutatott hatásának mérésével követtük. Az AT 2433 komplex antibiotikum elkülönítése és AT 2433 A1( A2, Bj és B2 antibiotikumokra való szétválasztása. Az AT 2433 komplex antibiotikumot úgy különítjük el, hogy a fermentlevet vízzel nem elegyedő oldószernek, például etil-acetátnak két térfogatnyi menynyiségével kétszer extraháljuk. A kivonatokat egyesítjük, bepároljuk, és a maradékot szénhidrogén oldószerben, például Skellysolve B-ben és metanolban oldjuk. 10 rész metanolhoz I rész vizet adunk, és az AT 2433 komplex antibiotikumot a folyadékok között megosztjuk. A vizes metanolos réteget elválasztjuk, és például Skellysolve B két térfogatnyi mennyiségével extraháljuk. További víz hozzáadásával a víz metanol térfogat arányát 1 : 3-ra állítjuk, és például széntetraklorid 3 térfogatnyi mennyiségével extraháljuk. Víz Ismételt hozzáadásával a víz : metanol térfogatarányt 1 : 2-re állítjuk, és hat térfogat kloroformmal vagy metilén-kloriddal extraháljuk. A kloroformos extraktumokat egyesítjük és bepároljuk. A maradékot közepes nyomáson kovasavgél oszlopon folyadékkromatografáljuk. eluálószerként a kloroform, metanol, víz 4 : 4 : 3 elegy alsó fázisát használjuk. Az eluálást elkezdjük és azt AT 2433 A, és A2 antibiotikumokat tartalmazó frakciókat (amelyeket kovasavgél vékonyréteg lemezen a hasonló Rr érték alapján határozunk meg) bepároljuk, így az AT 2433 A, és A2 elegyét kapjuk. Hasonló módon az A^ 2433 Bt -t és B2 t tartalmazó frakciókat is összeöntjük és bepároljuk, így az AT 2433 B] és Bj keverékét kapjuk. Az AT 2433 Ai és A2 keverékét közepes nyomáson kovasavgélen 1% ammónium-hidroxidot tartalmazó kloroform és 1% ammónium-hjdroxidot tartalmazó, 1 : 10 térfogatarányű metanol és kloroform elegy lineáris gradiensével folyadékkromatografáljuk. Az AT 2433 Aj-ét és A2-t tartalmazó frakciókat (vékonyréteg-kromatoráfiás meghatározás alapján) összeöntjük és szárazra pároljuk, így szilárd anyagot kapunk. Hasonló módon tisztítjuk az AT 2433 Bj-et és B2-t. Az AT 2433 Ai komponenst az AT 2433 A2-től közepes nyomásonson, oktadecfl-szilánnal kezelt kovasavgél (C-18 kovasagél) oszlopon folyadékkromatográfiás módszerrel választjuk el, eluálószerként acetonitril : metanol: 0,1 M ammónium-acetát 4 : 3 :3 térfogatarányú elegyét használjuk. Az eluciót vékonyrétegkromatográflásan követjük, és a szennyezett AT 2433 A! -et, illetve a szennyezett AT 2433 A2-t tartalmazó frakciókat összeöntjük és szárazra pároljuk. A szennyezett AT 2433 A, és A2 komponenseket a közepes nyomáson, C-18 kovasagélen végzett folyadékkromatográfiás eljárást ismételve tisztítjuk. Az AT 2433 Bj-t az AT 2433 B2-től közepes nyomáson, C-18 kovasavgélen végzett folyadékkromatográfiás módszerrel választjuk el, eluálószerként acetonitril : metanol : ammónium-acetát 4:3:3 térfogatarányú elegyet használunk. A találmány szerinti vegyületek, azaz az AT 2433 A,, AT 2433 A2, AT 2433 B; és AT 2433 B2 szerkezetét az infravörös, ultraibolya 1H és *"C NMR-spektruinok, valamint tömegspektrumok analízise alapján határoztuk meg. Az AT 2433 A,, AT 2433 A,, AT 2433 B, és AT 2433 B2 biológiai tulajdonságai: Az AT 2433 A,, AT 2433 A2, AT 2433 B, és AT 2433 B2 antibiotikumok antibakteriális hatásának meghatározására a vegyületeket számos Grampozitív és Gram-negatív organizmussal szemben in vitro vizsgáltuk. Az in vitro antibakteriális hatásvizsgálatokat a hagyományos agar hígításos módszerekkel Mueü- Hintom agaron (MHA) pH 7,4-en végeztük. A vizsgálat alapján az AT 2433 Ai, Á2, Bi és B2 antibiotikumokat Gram-pozitív baktériumokkal szemben hatásosnak találtuk. Mind a négy antibiotikum a legnagyobb antibakteriális hatást in vitro a Sarcina lutea-val (ATCC 9341) szemben fejtette ki, az AT 2433 Aj és B, minimális gátló koncentrációja (MIC) 0,25 (mcg/ml, MHA, 48 óra), az AT 2433 A2 és B2 minimális gátló koncentrációja pedig 1,0, illetve 4,0. A négy végyületnek meghatároztuk az in vitro antibakteriális hatását Bacillus subtilis (ATCC 6633), és két Staphylococcus törzs: falcium (ATCC 09790) és fascalis (ATCC 29212) esetében is. Az AT 2433 Bj in vitro hatást mutatott az E. coli SS 1431 Gram-negatív baktériummal szemben is. A minimális gátló koncentrációja 16.0 (mcg/ml, MHA, 48 óra). A találmány szerinti AT 2433 Aj és AT 2433 B1 vegyületek in vivo tumorellenes hatást fejtenek ki átültetett egér P-388 leukémia ellen. A tumorellenes hatást a standard Nation Cancer Institute vizsgálattal határoztuk meg, ameíyet a Cancer Chemother. Rcp. 3 : 1-103, (1972) irodalmi helyen közöltek. A vizsgálat során 10* p-388 leukémia sejtet (halálos dózis) adtunk be egerenként interperitoneálisan a 0. napon. A vizsgálandó vegyületeket sorozatban hígítottuk (1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 stb.) és minden oldatot interperitoneálisan adtunk be az egereknek az 1., 4, és a 7. napon. A vizsgálat eredményeit a VI. táblázatban foglaltuk össze. 5 10 15 20 25 3C 35 40 45 50 7
