194314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-glükozidáz gátló új pszeudooligoszacharidok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194 314 2 A teszt végrehajtása: Sertés hasnyálmirigyből nyert a-amllázt és a megvizsgálandó oldatokat együtt 1,0 ml 20 mmólos foszfátpufferban (pH 6,9 ♦ 10 mmól NaCl) 37°C-on 10— 20 percen át előinkubáljuk. Az enzimes reakciót Zulkowski szerint 1,0 ml oldható keményítő (a megadott pufferrel készített 0,25%-os oldat alakjában) hozzáadásával Indítjuk. Pontosan 10 perc múlva a reakciót 2,0 ml dinitroszalicflsav reagens (Boehringer Mannheim: Biochemica-Information II szerint) adagolásával leállítjuk, és az oldatot 5 percet át forró vízfürdőn tartjuk, hogy a szín kifejlődjék. Lehűlés után 546 nm hullámhosszon mérjük az extinkciót, az üres reagensekkel töltött küvetta ellen. Az 50%-os gátlást a nem gátolt enzimreakcióhoz viszonyítva állapítjuk meR, különböző mennyiségű inhibitor felfelhasználásával kalibráló görbét készítve. 1. példa A W-46 jelű inhibitor kinyerésének első lépéseként oltóanyagot tenyésztünk a mikrobiológiai gyakorlatban szokásos módon a Streptomyces galbus FH 1716, DSM 3007 sz. törzs fagyasztva szárított konzervált formájából, egyetlen telepet ferdeagaron passzálva. A fermentáláshoz szükséges mennyiségű spórát szintén szilárd táptalajon, Roux palackokban állítjuk elő. A szilárd táptalaj összetétele: dextrin 15,0 g/I nádcukor 3,0 húskivonat 1,0 élesztőkivonat 2,0 konyhasó 0,5 K2HP04 0,5 FeS04 x 7 H2O 0,01 agar-agar 2,0 PH = 7,3, sterilezés 120°C-on 20 percen át, inkubálás 30°C-on 9 napon át. A beoltott ferdeagart és a Roux-palackot 30°C-on 7 napon át inkubáljuk, majd + 4°C-on tartjuk. A spórákat 10 ml desztillált vízzel (vagy fiziológiás konyhasóoldat is alkalmas) lemossuk a táptalaj felületéről. Az így kapott szuszpenzió 5-4 ml-jével 200 ml-es Erlenmeyer lombik beoltásához használjuk fel. A lombikokban 500-500 ml sterilezett vizes, 7,7 pH-jú tápközeg van. összetétel (tömegű-bán): glükóz kazein-pepton húskivonat NaCl élesztőkivonat máj por 1,00 0,40 0,40 0,25 0,05 0,05. A lombikot + 30°C-on 220 perc’1 fordulatszámú rázógépen 48 órán át rázzuk. Az így kapott előtenyészetet 12 literes fermentorba visszük, amelyben 9 liter sterilezett vizes, 7,4 pH-jú tápoldat van. A főten vészét tápközegének összetétele az alábbi (tömegű): húskivonat 2,0 malátakivonat 2,0 kalcium-karbonát 1,0 habzásgátló 0,1 víz ad. 100 A főtenyészetet 28°C-on 2 napon át fermentáljuk, 850 perc 1 fordulatszám és 420 1/óra levegőztetés mellett. 18, 24, 30, 36, 40, 44 és 48 óra fermentálás után az o-amüázinhlbitor koncentrációját R. Bender 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 és társai (Anal. Biochem. 137, 307-312 (1984) előírása szerint meghatározzuk. A Str. galbus FH 1716 törzs a leírt kísérleti és termelési körülmények között 5 x 103 AIE/ml mennyiségű inhibitort termelt, a végső pH-érték 9,0 volt. 2. példa Az 1. példa szerint kapott 8 liter tenyészléből centrifuga segítségével elválasztjuk a biomasszát, a tiszta szürlet pH-értékét 9,5-re állítjuk. Az oldatot 0. 8 liter polisztirol-alapú adszorbeáló gyantát tartalmazó oszlopra visszük (Daion HP-20), az oszlopot 1.5 liter vízzel mossuk, majd víz-izopropanol-gradlenssel eluáljuk. A 10% izopropanolt tartalmazó elegy kioldja az inhibitort az oszlopról. Az aktív frakciókat (1,2 liter) ultraszűréssel betöményítjük és víz hozzáadása mellett további ultraszűréssel teljesen sómentesítjük. A kapott koncentrátumot (0,2 liter) szulfopropil-csoportokkal módosított cellulóz adszorbensen (H*-formájú SP-Spehadex) szétválasztjuk, eluensként ammónium-acetát-gradienst (0-0,5 mólos) alkalmazva. Az a-amilázgáöó anyagot tartalmazó frakciókat ultraszűrő cellákban (Amicon) feldúsítjuk és sómentesítjük. A végleges tisztításhoz poliakrilamid-gélt (Biogel P-6) és futtató folyadékként tiszta vizet alkalmazunk. A W-46 jelű inhibitort tartalmazó frakciókat gyűjtük és fagyasztva szárítjuk. 1,5 g amorf, drapp színű port kapunk, amelynek a-amiláz-gátló aktivitása 4 x 104 AIE/mg. Az 1. ábra az anyag KBr-ban felvett IR-színképét, a 2. ábra a dimetil-szulfoxidban felvett NMR-színképet mutatja. 3. példa A 2. példa szerint kapott inhibitor-elegy 100 mgját 0,01%-os, 7,8 pH-jú foszfátpufferben oldjuk, és az anyagokat 150 g Lichrosorb RP 18 hordozón acéloszlopban nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel szétválasztjuk. Eluensként 95% 0,01%-os foszfátpuffert (pH 7,8,5% acetonnitril) alkalmazunk, az eluátumok vizsgálata 210 nm hullámhosszán végzett UV-adszorpció méréssel történik. 4, 5, 8, illetve 7.5 perc elteltével jelenik meg az inhibitor hatású anyag, külön-külön kinyerjük. A frakciókat betöményítjük, sómentesftjük és fagyasztva szárítjuk. Az alábbi elemzési adatokat kapjuk: 1. csúcs: (a nagynyomású folyadékkromatográfla 4. perce után): C: 45,8%, H: 6,5%, N: 2,1%, 0:46,0%. ♦ FAB-tömegspektrográflával 1467-nél M+H -csúcsot találtunk (W-46 C), (East Atom Bombardment) II. csúcs (a nagynyomású folyadékkromatográfla kezdete után 5,8 perccel): C: 46,1%, H: 6,5%, N: 2,1%, 0:45,4%. FAB-tömegspektrográfla: M+H* -csúcs 1305-nél (W-46 B), III. csúcs: (a nagynyomású folyadékkrotmatográfla kezdete után 7,5 perccel), C: 46,3%, H: 6,5%, N: 2,5%, O'44,8%, FAB-tömegspektrográfla: M+IT-csúcs 1143-nál (W- 46 A). 4. példa A 2. példa szerint kapott anyag 100 mg-ját 0,5 ml 4
