194313. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új alfa-glüközidáz inhibitor és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 194313 2 elősegíti. Az új Inhibitor tehát a fogszuvasodás megelőzésére vagy visszaszorítására is alkalmazható. Végül a vegyület biokémiai reagensként és diagnosztikai eszközként alkalmazható. Amiláz-teszt Egy amilázinhibitor-egység (AIE) definíció szerint az az inhibitor mennyiség, amely rögzített kísérleti körülmények között két amfláz-egységet (AE) 50%-ig gátol. Egy amiláz-egység a nemzetközi megállapodás szerint az az enzim mennyiség, amely a keményítőben 1 perc alatt 1 mikroegyenértéknyi glükózkötést bont. A bontott glükozid-kötések mikroegyenértékeit a redukáló cukor mikroegyenértékeiként határozzuk meg, fotometrikusan, dinitroszalicilsawal, majd kalibráló görbe segítségével maltóz-mikromólban fejezzük ki. A teszt végrehajtása: Sertés hasnyálmirigyből nyert ttamilázt és a megvizsgálandó oldatot együtt 1,0 ml 20 mmólos foszfátpufferben (pH = 6,9 + 10 mmól NaCl) 37°C-on 10-20 percen át előinkubáljuk. Az enzimes reakciót Zulkowski szerint 1,0 ml oldható keményítő (a megadott pufferrel készített 0,25%-os oldat alakjában) hozzáadásával indítjuk. Pontosan 10 perc múlva a reakciót 2,0 ml dinitroszalicilsav reagens (Boehringer Mannheim: Biochemica-Information II szerint) adagolásával leállítjuk, és az oldatot 5 percen át forró vízfürdőn tartjuk, hogy a szín kifejlődjék. Lehűlés után 546 nm hullámhosszon mérjük az extinkciót, az üres reagensekkel töltött küvetta ellen. Az 50%-os gátlást különböző inhibitor-mennyiségek felhasználásával kalibráló görbét rajzolva állapítjuk meg, 1. példa Az AI-5662 inhibitor előállítása céljából a mikrobiológiai gyakorlatban szokásos módon a Streptomyces novo species FH 1717 DSM 3006 fagyasztva szárított, konzervált formájából egytclepes passzálás és ferdeagaras tenyésztés útján oltóanyagot készítünk. A fermentáláshoz szükséges mennyiségű spórákat szintén szilárd táptalajon, Roux-palackokban tenyésztettük. A lemez, ferde agar és Roux-palack táptalaja 40 g zabpelyhet finomra őrölünk, 950 ml csapvízzel felengedjük és 5 percen át ultra turrax turmix készülékkel homogenizáljuk. A szuszpenzióhoz 18 g agart adunk, majd az elegyet 120°€-on 20 percen át sterilizáljuk. A beoltott kémcsövet, valamint a Roux-palackot 5 napon át 28°C-on inkubáljuk, utána *4°C-on tartjuk. A spórákat 10 ml sterilizált desztillált vízzel (fiziológiai konyhasóoldat is alkalmas) lemossuk a szilárd táptalajról, 2000 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 500 ml sterilizált vizes, 7,3 pH-)ú táptalajt beoltunk 5 ml szuszpenzióval. A táptalaj tömegszázalékos összetétele: glükóz 1,00 kazein-peplon 0,40 húskivonat 0,40 NaCl 0,05 élesztőkivonat 0,05 májpor 0,05 A lombikot 28°C-on 110 perc'1 frekvenciájú rázógépen 24 órán át rázzuk, utána a kapott előtenyészetet 12 literes Braun-fermcntorba töltjük, amelyben 9 liter sterilizált vizes, 7,4 pH-jú, alábbi összetételű (tömeg%) tápközeg van. húskivonat 2,0 malátakivonat 2,0 kalcium-karbonát 1,0 habzásgátló 0,1 víz ad 100 A főtenyészetet 28°C-on, 500 perc'1 rázófrekvencia és 120 1/óra szellőztetés mellett 4 napon át fermentáljuk. 24, 48, 60, 72, 84 és 96 óra múlva az a-glükozidáz-inhibitor koncentrációját R, Bender és társai (Anal. Biochem. 137, 307—312 (1984) előírása szerint meghatározzuk. Az ismertetett körülmények között a Str. nov. spec. FH 1717 törzs átlagosan 3xl03 AEI/ml mennyiségben termelte az inhibitort, a tenyészlé végső pH-értéke 8,8 volt. 2. példa Az 1. példa szerint előállított tenyészlé 8 literjéből centrifugával eltávolítjuk a biomasszát, és a száriét pH-értékét 9,5-re állítjuk. Utána az oldatot 0,8 liter polisztirolgyanta adszorbenst (Diaion HP-20) tartalmazó oszlopra visszük, 1,5 liter vízzel mossuk, majd víz és izopropanol gradienssel eluáljuk. Az 5% izopropanolt tartalmazó ‘ elegy kioldja az AI 5662 inhibitort az oszlopról. Az aktív eluáturnokat (1,5 liter) ultraszűréssel betöményítjük, vízzel hígítjuk, további ultraszűréssel addig sómentesítjük, míg só mát nem mutatható ki. A kapott 0,2 liter koncenjrátumot szulfopropil-csoportokkal módosított, H - formájú cellulóz (SP-Sephadex) adszorbensen, eluensként 0-1 mólos ammónium-acetát-gradienssel alkalmazva elválasztjuk az a-anifláz-inhlbitort tartalmazó frakciót, ultraszűrő cellákban (Amicon) betöményítjük és sómentesítjük. A fagyasztva szárított aktív anyagot Kieselgel oszlopra (3x35 cm) visszük, majd n-propanol, etil-acetát, víz és jégecet 6 : 1 : 3 :0,5 arányú elegyével nyomás alatt eluáljuk. Az aktív frakciót vákuumban oldószermentesítjük, a maradékot vízben oldjuk, az oldat pH-értékét 9-re állítjuk és Biogel P 6 adszorbens alkalmazásával, vízzel eluálva tisztítjuk. A kapott aktív anyagot fagyasztva szárítjuk: 0,8 g fehér amorf port kapunk, amelynek az a■ -amiláz-gátló aktivitása 4xl04 AIE/mg. A mellékelt ábrán a kálium-bromidban felvett IR-színképet közöljük. Az elemanalízis 47,6% szenet, 6,7% hidrogént, 2,5% nitrogént és 43,2% oxigént mutatott ki. 3. példa A 2. példa szerint előállított inhibitor 200 mg-ját 1 ml vízben feloldjuk, az oldatot jeges fürdőben kénsawal pH 2-re savanyítjuk, majd acetonnal 10 ml térfogatra kiegészítjük és 30 percen át állni hagyjuk. A csapadékot szűrjük, majd vízben oldjuk és az oldatot fagyasztva szárítjuk. 204 mg AI-5662 inhibitor-szulfátot kapunk. 4. példa A 2. példa szerint kapott inhibitor 50 g-ját 946 g mannlttel és 4 g citromsawal összekeverjük, az elegyet őröljük, majd vízzel nedvesen granuláljuk. A granulátumot szárítószekrényben szárítjuk, majd 500 rng-os adagokban légmentesen záró réteggel ellátott kis tasakokba töltjük. Az így nyert granulátum vízben oldható, de szórókészítményként is alkalmazható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
