194311. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új savas policiklusos éter-antibiotikumok előállítására
1 194 311 2 ják a szénhidrátokat és Így monoszacharidok képződnek, majd ezek a monoszacharidok pinrvátvegyietekké alakulnak át. A piruvátok mikrobiológiai folyamatokban acetátokká, butirátokká vagy propionátokká metaboHzálódnak, melyeket együttesen illékony zsírsavaknak (VFA) nevezünk. (Részletesebb ismertetéshez lásd: „Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant”, Phillipson és munkatársai, szerkesztők, Oriel Press, Newcastle-upon- Tyne, Anglia, 1970, 408-410. oldal.) A VFA felhasználás relativ hatásosságát tárgyalja MçCuüogh (Feddstoffs, 1971. június 19, 19. oldal), Eskeland és munkatársai (J. An. Sei. 33, 282 (1971), és Church és munkatársai, („Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants’, 2. kötet, 1971, 622-625. oldal). Bár az .acetátok és butirátok felhasználódnak, a propionátok nagyobb hatékonysággal hasznosulnak. Egy jótékony hatású vegyület ezért arra serkenti az állatot, hogy a szénhidrátokból nagyobb arányban képezzen propionátokat, növelve ezzel a szénhidrátfelhasználás hatékonyságit. Az állati takarmány értékét közvetlenül az állat táplálása útján határozzák meg. Az 1,197,826 számú brit szabadalmi leírás részletesen leír egy in vitro bendőtechnikát, mellyel a táplálékban bekövetkező, mikroorganizmusok okozta változások könnyebben és nagy pontossággal lemérhetők az állati takarmány értékelésekor. E technikához használt készülék segítségével az állatok emésztési folyamata in vitro modellezhető és vizsgálható. Az állati takarmányt, bendő-inokulumot és különböző növekedésserkentő anyagokat egy laboratóriumi egységbe visznek be, majd onnan eltávolítják gondosan ellenőrzött körülmények között és a létrejött változásokat kritikusan és fokozatosan tanulmányozzák, miközben a táplálékot a mikroorganizmusok megemésztik. A bendőfolyadék propionsavtartalmának növekedése azt jelzi, hogy az egész kérődző folyamatban kívánt reakciót váltott ki a tápkészítményben levő növekedésserkentő anyag. A propionsavtartalom változását a kontroll bendőfolyadékban talált propion-savtartalom %-ában fejezzük ki. Hosszan tartó in vivo táplálási vizsgálatokat végzünk annak a kimutatására, hogy megbízható összefüggés áll fenn a bendőfolyadék propionsavtartalmának növekedése és a jobb állati teljesítmény között. A bendőfolyadék sipollyal ellátott borjúból gyűjtjük, melyet szokványos hizlaló tápon és szénán tartunk. A bendőfolyadékot sajtvásznon azonnal átszűr-Íük. és 10 nd-ét 400 mg standard sztibsztrátot (68% Lukoricakcményítő ♦ 17% cellulóz +15% extrahált szójaliszt), 10 ml 6,8 pH-jú puffert és a vizsgálandó vegyületet tartalmazó 50 ml-es kúpos palackhoz adjuk. A palackokat oxigénmentcs nitrogéngázzal körülbelül 2 percig átöblítjük, és rázó vízfürdőben 39 C-on mintegy 16 óráig inkubáljuk. Minden esetben 3 párhuzamos próbát végzünk. Inkubálás után 5 ml mintát 1 ml 25% metafoszforsawal keverünk össze. 10 perc múlva 0,25 ml hangyasavat adunk hozzá és a keveréket 10 percig percenkénti 1500 fordulattal'centrifugáljuk. Utána a mintákat gáz-folyadékkromatográflával elemezzük D. W. Kellogh (J. Dairy Sei. 52, 1960 (1969)) módszerével. Az ecetsav, propionsav és vajsav csúcsok magasságát meghatározzuk a kezeletlen és kezelt inkubációs palackok mintáiból. A leirt in vitro eljárással vizsgálva a CP-63,517 antibiotikum 20 és 10 pg/ml koncentrációban 96% 8 illetve 95%-kal fokozza a propionsavképződést, a CP-63,517 antibiotikumot nem tartalmazó kontroll oldathoz viszonyítva, összehasonlításképpen, a kereskedelmileg kapható Monetudn (másik poÚdklusos éter antibiotikum) 10 pg/ml koncentrációban körülbelül 20%-os proponsavemelkedést okoz a kontrollal szemben (J. Am. Chem. Soc. 89, 5737 (1967)). összehasonlítva a Szalinomicinnnel (J. Antibiotics 27, 814 (1974)), a CP-63,517 antibiotikum 86%-kal növeli a propionsavat 20 pg/ml koncentrációban, és körülbelül 66%-os emelkedést eredményez 5 figliiű koncentrációban, összehasonlítva a 10 pg/ml SzaUnomicin mintegy 65%-os propionsav-fokozásával. Ezen adatok alapján arra lehet következtetni, hogy a CP-63,517 antibiotikum megjavítja kérődzők, mint marha és juh, valamint egygyomrú állatok, mint sertés és nyúl takarmányhasznositását. A CP-63,517 antibiotikum szabad sav, nátriumsó, káliumsó vagy ezek keverékei formájában dolgozható be a takarmányba. A CP-63,517 antibiotikum nyers formái, vagy az antibiotikumot tartalmazó szárított fermentlé a kívánt hatásosságú koncentrációkban keverhetők össze a tápkészítményekkel. A következő példa kizárólagos célja a találmány további bemutatása. Példa CP-63,517 antibiotikum izolálása à fermentlé bői ATCC-39574 tenyészet 10 fermentációs edényének teljes fermenüevét (össztérfogat körülbelül 25 liter) ^2t6rf°8at metfl-izobutfl-ketonnal extraháljuk. A kivonatot vákuumban bepároljuk. A kapott barna olajat kromatográfiás minőségű, edl-acetátban felvett szilikagéllel töltött 5x100 cm-es oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot etil-acetáttal fejlesztjük ld 10 ml/perc átfolyási sebességet alkalmazva. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk. E frakciókat rétegkromatográviával vizsgáljuk etil-acetáttal eluált szilikagélenlemezeken. A lemezeket 3%-os etanolos vanfllinoldat - 85% foszforsavoldat (3:1) eleggyel permetezzük be és 80°C-on hevítjük. A kívánt CP-63,517 antibiotikum ilyen körülmények között zöld folt alakjában jelenik meg. A CP-63,517 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük (össztérfogat körülbelül 300 ml) és 15 percig 2 g „Darco G60” aktív szénnel (JC1 America Inc., Wilmington, Delaware 19899) keverjük. A keveréket átszűijük, a szürletet 300 ml 5% dinátrium-hidrogén-foszfát pufferrel keverjük és a pH-t In nátrium-hidroxid-oldattal 10,0-re állítjuk be. A fázisokat szétválasztjuk és az etÜ-acetátot vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, szűrjük és vákuumban bepároljuk. A visszamaradt viszkózus olajat kevés acetonban oldjuk. A képződött kristályokat szűréssel összegyűjtve és vákuumban megszáritva 800 mg CP-63,517 antibiotikumot kapunk nátriumsó alakjában, olvadáspont 215-220°C. UV spektrum, “ 232 nm. Infravörös spektrum (KBr) cm'1 : 3436, 2964, 2928, 2871, 2728, 1666, 1563, 1462, 1404, 1372, 1319, 1293, 1271, 1234, 1205, 1167, 1100, 1050, 1033 , 995, 980, 940, 926,902,858,538. Optikai forgatás: ajj * *25 C (c ■ 0,5, metanol). fi 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
