194311. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új savas policiklusos éter-antibiotikumok előállítására

1

Alkotórészek Cerelóz

Kukoricakeményítő Szójaliszt NZ Amine YTT*

Kobalt-klorid Kalcium-karbonát ‘Kazein enzimes hidrolizátumának bejegyzett márkaneve, Humko Sheffield Co., Inc.

1 ml habzásgátló szert adunk hozzá, majd a palackot légmentesen lezáijuk és 120°C-on és 9,33.104 PA nyomáson 45 percig sterflezzük. Az edényeket az egyik palackkal (körülbelül 3% inokulum) beoltjuk, 96-144 óráig 30°C-on fermentáljuk, 1700 CPM-mcl keverjük, és a levegőztetés mértéke 1 térfogat levegő per térfogat folyadék per perc.

Amikor a fermentáció befejeződött (B. subtilis ATCC 6633 elleni antibiotikus korongpróba alapján), a fermentorokat leállítjuk és tartalmukat a természetes pH-n szűrési segédanyagot, például celitet használva leszűijük. A szűrőtésztát metanolban szuszpendáljuk, vákuumban bepároljuk, 2-3 térfogat vízzel felhígítjuk, majd kétszer 1/3—1/2 térfogat vízzel nem elegyedő oldószerrel, mint metfl-izobutfl-ketonnal vagy n-butanollal extraháljuk. Az oldószerréteget a vizes fázistól leszívással vagy centrifugálással elválasztjuk, szüljük és a szürletet vákuumban bepárolva viszkózus olajat kapunk.

A fermentáló biológiai aktivitását, majd a kinyert anyagot Bacillus subtilis ATCC 6633 vagy Staphylococcus aureus ATCC 6538 érzékeny törzsének alkalmazásával követjük. A fermentlé komponenseit és a kinyert anyagokat rétegkromatográ fiával (TLC) tesszük láthatóvá szilikagél [Silica gel G (70-230M ASTM) E. MerckJ lemezeket és tiszta etfl-acetátot használva. A kifejlesztett lemezeket vanillin reagenssel (3 g vanillin 75 ml etanolban és 25 ml 85% foszforsavban) permetezzük be és 80°C-ra melegítjük. A CP-63,517 antibiotikum zöldes folt alakjában jelenik meg. A kifejlesztett TLC-lemezre S. aureusszal vagy B, subtilis-szel beoltott agart is rétegezhetünk, melyhez tetrazolium-festéket (23,5-trifenil-2H-tetrazolium-klorid-monohidrát, 98%, Aldrich Chemical Co., Inc. T-8485-9) adtunk és 37°C-on 16 óráig inkubáljuk az antibiotikum láthatóvá tétele céljából (rózsaszín háttérben fehér).

Nagy méretű fermentorokhoz az eljárást úgy adaptáljuk, hogy 0,7 liter CL13MZ vagy JDY TT tápközeget tartalmazó rázólombikot készítünk. A rázólombik inokulumát 3-5 napig 28°C-on fermentáljuk. A rázólotnbik inokulumát 3-5 napig 28°C-on fermentáltuk és 96 vagy 4600 liter JDY TT tápközeget tartalmazó 190 vagy 6540 literes fermentor beoltására használjuk. Megközelítőleg 1 liter inokulumot használunk a kádban. 5-7 napi fermentálás után a fermentor tartalmát összegyűjtve 96 vagy 4230 liter fermentlevet kapunk. A teljes fermentlevet 1/5 térfogat metil-lzobutil-ketonpal extraháljuk ter-CN-2

Gramm/liter

10

10

10

10

0,02

1

194 311

mészetes pH-,n, „Alpha DeLaval -szeparátoron vagy .JPodMelnink’ -extraktoron elválasztjuk és az oldószert vákuumban bépároljuk. A kapott olajat to- 5 vább koncentráljuk, szirupot kapunk, melyet heptánban szuszpendálunk, szfllkagéUel keverünk,.szilikagél-ágyon átszűrjük és a gélt többször heptánnal mossuk. Az antibiotikumot fokozatosan eluáljuk kloroformmal, klorofonn/etil-acetát eleggyel, etil-acetóttal és végül 50% acetont tartalmazó étŰ-acé* 10 tóttal. Az cluciót rétegkromatográfla és a frakciók biológiai próbája követi. Az aktív frakciókat egyesítjük, bepároljuk és újra kromatografáljuk a CP-63,517 antibiotikum izolálása céljából. Az aktív eluátumok szemcsés szén-oszlopon való átbocsátó sa eltávolítja a zavaró anyagokat, és javítja a kinyerést, úgyhogy 'ö kristályos CP-63,517 antltiotikumot kapunk.

A találmány szerinti I általános képletű antibiotikumos vegyidet savas jeDcgű, és bázikus reagensekkel reagál tatva kationos sókat képez. Minden ilyen só beletartozik a találmány hatókörébe. E só- 20 kát polléter (ionofor) antibiotikumok előállítására használatos módszerekkel állítjuk elő. Az egyik eljárás szerint az i általános képletű vegyületet illékony, vízzel nem elegyedő szerves oldószerben oldjuk és az oldatot legalább 1 ekvivalens, de előnyösen nagy feleslegű alkalmas bázikus reagenst 25 tartalmazó vizes oldattal kezeljük. A szerves oldószeres oldatot szárítás után vákuumban bepároljuk és így a kívánt kationos sóhoz jutunk. A használható jellemző bázikus reagensek közé tartoznak alkálifém-hidroxidok, mint nátrium-hidroxid és kálium-hidroxid, alkáliföldfém-hidroxidok, mint kalcium- 30 -hidroxid és bárium-hidroxid, és ammónium-hidroxid.

A CP-63,517 antibiotikum számos Grampozitiv mikroorganizmus növekedését gátolja. Az alábbi I. táblázatban az in vitro MIC-próbák eredményeit ne összegezzük. E próbához mindéit organizmust beoltunk a CP-63,517 antibiotikum kémcsősorozatából, hogy meghatározzuk az antibiotikum minimális koncentrációját mcg/ml-ben, amely az organizmus növekedését 24 órás időszak alatt gátolja (MIC, legkisebb gátló koncentráció).

4Q A sertés-dizentéria egyike az Egyesült Államokbeli diagnosztizált leggyakoribb sertésbetegségeknek. Ezenfelül a betegség sok más országban is gyakori és a sertéstenyésztőknek évente sok ezer dolláros veszteséget okoz az egész világon. Újabban felfedezték, hogy egy nagy spirochaeta okozza a betegséget. 45 Ezt az organizmust, a Treponema hyodysenteriae-t most izolálták és kimutatták, hogy képes e betegség előidézésére [Harris D. L. és munkatársai, „Swine Dysentery-1 Inoculation of Pigs with Treponema hyodysenteriac (New Species) and Reproduction of the Disease”, Vet. Med/SAC, 67. 61-64 (1972)]. 50 Megjegyzendő, hogy nem tudjuk, vájjon a T. hyodysenteriae a sertés-vérhas egyetlen kórokozója-e. Mégis a rendelkezésre álló adatokból arra lehet következtetni, hogy a fertőzés elsődleges forrása.

5