194310. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új TAN-588 antibiotikum alkálifém-, alkáliföldfém-, ammóniumsójának és N-dezacetilezett-származékának előállítására
1 194 310 2 sékleten tartjuk, 50 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 200 fordulat/perc sebességű keverővei kevertetjük 48 órán át. A kapott tenyészetből 6 1-t egy 200 1 térfogatú fermentor tartályban lévő 120 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5), és összetétele a következő: 3 v% dextrin, 1,5 v% nyers szójallszt, 1,5 v% kukoricasikér-liszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátrium-tloszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzás^átlóval. Az inkubálás folyamán a tenyészetet \TC hőmérsékleten tartjuk, 200 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 150 fordulat/perc sebességű keverővei kevertetjük 66 órán át. Kétszer megismételve a fenti tenyésztési eljárást, a kapott 230 1 folyékony tenyészet pH-ját 8-ra állítjuk be, majd leszűrjük. A szűréshez 9 kg Hyflo Super Cel (gyártó cég: Johns Manville Co., USA) szűrőközeget használunk. A 200 1 szürlet IRA-402 (Cl típus) (gyártó cég: Rohm and Haas Co., USA) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 2 v% vizes nátrium-klorid oldattal eluáljuk. Az 53 1 eluátum pH-ját 6-ra állítjuk be, és 5 1 aktívszénnel (gyártó cég: Takeda Chemical Industries Ltd., Japán) töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 8 v% izo-butanollal eluáljuk. A 14 1 cluátumot vákuum alkalmazásával 5 1 térfogatra koncentráljuk. A koncentrátum pH-ját 6-ra állítjuk be és kétszer 2.5 1 2 v% tri-n-oktil-metil-ammónium-klorid— metilén-klorid oldattal extraháljuk. Az extraktumot 2.5 1, 1,6 v% vizes nátrium-jodiddal kezeljük. A vizes fázist betöményítjük és 500 ml aktívszénncl töltött oszlopon kromatografáljuk. Eluálószcrként 8 v% izobutanolt használunk. Az eluátumot betöményítjük, majd liofilizáljuk. 1,41 g por formájú anyagot kapunk, amit 100 ml vízben feloldunk, majd az oldatot 200 ml OAE-Sephadex A-25 (Cl típusú) (gyártó cég: Pharmacia Co., Svédország) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az cluáláshoz 0,03 mólos vizes nátrium-klorid oldatot használunk. A frakciókat összcgyűjtük. 600 ml eluátum pH-ját 5,1-re állítjuk be és sótalanítjuk aktívszénncl töltött oszlopon. Az eluátumot bepároljuk és liofilizáljuk. 384 mg port kapunk, amit vízben feloldunk. Az oldatot preparatív folyadékkromatográfiás módszerrel tisztítjuk tovább. A kromatografálást YMC-Pack SH-343 folyadékkromatográffal (gyártó cég: Yamamura Chemical Laboratories, Japán) végezzük. Eluálásra 0,01 mólos foszfát-puffért (pH 6,3) használunk. Az antibiotikumot tartalmazó cluátumokat összegyűjtjük, aktívszénnel töltött oszlopon sótalanítjuk. Az eluátumok bepárlása, majd líofilizálása után 141 mg TAN-588 antibiotikum nátriumsóját kapjuk, fehér por formájában. 2. példa Empedobacter lactamgenus YK-258 (1FO 14322, FERM BP-699) szilárd táptalajon tenyésztett törzset 2 1 térfogatú Sakaguchi edényekben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH 7,0) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 3 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójallszt, 0,5 v% Polypepton és 0,3 v% nátrium-klorid kiegészítve 0,5 v% preclpitált kálcium-karbonáttal. Az edényeket 24°C hőmérsékleten 48 órán át rázatva inkubáljuk. Az ilymódon kapott folyékony tenyészetet ezután egy 200 1 térfogatú fermentor-tartáíyban lévő 120 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj összetétele a fentivel megegyező, 0,05 v% Actcol márkanevű habzásgátlóval kiegészítve. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 24°C hőmérsékleten tarjtuk, 2001/perc levegőárammal levegőztetjük és 150 fordulat/perc sebességű keverővei kevertetjük 48 órán át. A kapott 60 1 tenyészetet egy 2000 1 térfogatú fermentor-tartályban lévő 1200 1 táptalajba oltjuk át. A táptalaj egy vizes oldat (pH 6,5) és összetétele a következő: 3 v% dextrin, 1,5 v% nyers szójaliszt, 1,5 v% kukoricasikér-liszt, 0,2 v% Polypepton és 0,1 v% nátrium-tioszulfát, kiegészítve 0,05 v% Actcol habzásgátlóval. Az inkubálás folyamán a tenyészetet 17°C hőmérsékleten tartjuk, 2000 1/perc levegőárammal levegőztetjük és 120 fordulat/perc sebességű keverővei kevertetjük 90 órán át. A kapott folyékony tenyészetet Hyflo Super Cel. szűrőközeget használva leszűrjük. Az 1150 1 szürletet 40 1 Amberlite IRA- 402 (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 200 1 2 v% vizes nátrium-klorid oldattal eluáljuk és az eluátumot 20 1 aktívszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopról az antibiotikumot 81 1 8 vVc izo-butanollal eluáljuk, majd J0 1 Amberlite IRA-68 (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az cluálást 1 v% vizes nátrium-klorid-oldattal végezzük. A kapott 54 1 eluátumot 10 1 aktívszénncl töltött oszlopon ismét kromatografáljuk. Az antibiotikum cluálásához 8 v% vizes izo-butanol-oldatot használunk. A 80 1 eluátumot vákuum alkalmazásával 5 1 térfogatra koncentráljuk. A koncentrátum pH-ját, 4,5-re állítjuk be és kétszer 2.5 1 2 v% tri-n-oktil-mctil-ammónium-klorid---metilén-klorid oldatta] extraháljuk. Az extraktumot 1.6 v% vizes nátrium-jodiddal kezeljük. A vizes fázist 1,5 1 térfogatra töményítjük be és 0,5 1 aktívszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluátumot betöményítjük, majd a koncentrátumot 200 ml OAE-Scphadcx (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluáláshoz 0,03 mólos vizes nátrium-klorid-oldatot használunk. .1,3 1 frakciót összegyűjtünk és sótalanítjuk 500 ml aktívszénnel töltött oszlopon. Az eluátumot bepároljuk és liofilizáljuk. 3,56 g TAN-588-at kapunk fehér por tonnájában. Az extrahálásnál kapott 5 1 vizes fázist — ami az antibiotikum 50%-át tartalmazza - OAE-Sephadex (Cl típus) hordozóval töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást 0,03 és 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldattal végezzük, majd az eluátumot 2 1 aktívszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az eltávozó 2 1 nátrium-klorid oldatot ismét kétszer 1 1 2 y% tri-n-oktfl-metil-ammónium-kloríd-moíílén-klorid oldattal extraháljuk. Az extraktumot vizes nátrium-jodid-oldattal kezeljük, majd aktívszénnel töltött oszlopon sótalanítjuk. 3,18 g TAN-588 antibiotikum nátriumsóját kapjuk fehér por alakjában. A kapott anyag IR- és NMR — spektruma azonos az 1. példában előállított termék spektrumaival. 3. példa Lysobacter albus sp. nov. YK422 (IFO 14384, FERM BP-698) szilárd táptalajon tenyésztett törzset 2 1 térfogatú Sakaguchi edényekben lévő 500 ml táptalajra oltunk be. A táptalaj egy vizes oldat (pH beállítás nélkül) és összetétele a következő: 2 v% glükóz, 2 v% oldható keményítő, 1 v% nyers szójallszt, 0,5 v% Polypepton. Az edényeket 24°C hőmérsékle-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
